乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR- 荧光探针法）体外诊断试剂产品注册技术审评报告

体外诊断试剂产品注册技术审评报告 

产品中文名称：乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR- 荧光探针法） 

产品管理类别：第三类 

申请人名称：北京热景生物技术股份有限公司 

国家药品监督管理局 

医疗器械技术审评中心

目录

基本信息.....................................................................................3 

一、申请人名称.........................................................................3

二、申请人住所.........................................................................3 

三、生产地址.............................................................................3 

技术审评概述.............................................................................4 

一、产品概述.............................................................................4 

二、临床前研究概述 .................................................................5

三、临床评价概述 ................................................................... 12

四、产品受益风险判定 ........................................................... 15 

综合评价意见........................................................................... 18

基本信息

一、 申请人名称 

北京热景生物技术股份有限公司 

二、申请人住所 

北京市大兴区中关村科技园区大兴生物医药产业基地天富 街 9 号 9 幢 

三、生产地址 

北京市大兴区中关村科技园区大兴生物医药产业基地天富 街 9 号 9 幢

技术审评概述 

一、产品概述 

(一) 产品主要组成成分 

本试剂盒由 A 盒（磁珠法核酸提取试剂）和 B 盒（扩增 反应试剂）组成，主要组成成分见表 1。 表 1 试剂盒主要组成成分 

A 盒：

B 盒：

具体内容详见产品说明书。

（二）产品预期用途 

本试剂盒用于体外定量测定人血清样本中的乙型肝炎 病毒 RNA（HBV-RNA）。

已有研究数据显示，外周血血清中 HBV-RNA 可反映肝内 HBV 病毒的转录活性，在部分血清中 HBV DNA 低于检测下限 的样本中，HBV-RNA 仍可以被检测到。同时，在 NAs 治疗 中，血清 HBV-RNA 可辅助作为 HBeAg 转阴的预测的指标之一， 血清 HBV-RNA 结果为阴性，需要结合其他指标共同用于指导 NAs 的治疗。该检测结果不得作为患者病情评价的唯一指标， 必须结合患者临床表现和其他实验室检测对病情进行综合 分析。本试剂盒不得用于 HBV 的血液筛查。 

（三）产品包装规格  

48 人份/盒。 

（四）产品检验原理 

本试剂盒（PCR-荧光探针法）采用磁珠法提取血清中的 HBV-RNA。特异性地检测 HBV-RNA 的保守区域。检测试剂内 含有一条反转录引物、一对特异性扩增引物以及一条荧光探 针，与 RT-PCR 反应缓冲液，Taq 酶，逆转录酶等共同配制成 RT-PCR 反应液，在实时荧光定量 PCR 仪上进行一步法 RT-PCR 扩增，实现对血清样本中 HBV-RNA 的检测。

二、 临床前研究概述

( ) 1.主要原材料的选择 

本产品的主要原材料包括：引物、探针、假病毒、RT-PCR 反应体系（包括 10×RT-PCR Buffer（含 dNTPs）、逆 转录酶和 TaqDNA 聚合酶混合液）、磁珠法核酸提取试剂 等，这些原材料均是通过外购方式获得。其中，引物和探针 均为申请人自行设计，由专业的合成公司合成和纯化后获 得。 

申请人从有资质的供应商中，通过功能性试验，筛选出最佳原材料和供应商。制定了各主要原材料质量标准并经检 验合格。 

2.企业参考品设置情况 

该产品企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、精密 度参考品、检出限参考品、准确度参考品、样本线性参考 品、核酸提取功能参考品，参考品采用临床样本制备而成。 组成如下： 

阳性参考品共 10 份，分别命名为阳性参考品 P1~P10， 来源于 HBV-RNA 阳性样本，涵盖 B 型、C 型和 D 型。 

阴性参考品共 10 份，分别命名为阴性参考品 N1~N10， 涵盖正常人样本、巨细胞病毒、EB 病毒、人类免疫缺陷病毒 1 型、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和梅毒样本。 

精密度参考品共 2 份，分别命名为精密度参考品 J1~J2，采用 HBV-RNA 阳性样本梯度稀释而成。 

检出限参考品 1 份，命名为检出限参考品 S1，采用 HBVRNA 阳性样本稀释而成，浓度为 300copies/mL 。

  准确度参考品共 5 份，分别命名为准确度参考品 Y1~Y5， 采 用 HBV-RNA 阳 性 样 本 梯 度 稀 释 而 成 ， 浓 度 分 别 为 2.0×107 copies/mL 、 2.0×106 copies/mL 、 2.0×105 copies/mL 、 2.0×10 4 copies/mL、2.0×103 copies/mL。 

样本线性参考品 1 份，命名为样本线性参考品 L，采用 HBV-RNA 阳性样本稀释而成。 

核酸提取功能参考品共 12 份，分别命名为核酸提取功能 参考品 T1~T12，其中 T1~T8 采用含内源性干扰物质的 HBVRNA 阳性样本稀释而成，T1、T5、T9 含血红蛋白，T2、T6、 T10 含甘油三脂，T3、T7、T11 含总 IgG，T4、T8、T12 含 总胆红素，T9~T12 为阴性血清样本。 

以上临床样本采用数字 PCR 法和实时荧光 PCR 法进行 确认。各企业参考品用于产品准确性、特异性、检出限、精 密度、线性、核酸提取功能等的检测。 

本试剂盒设置了阳性质控品和阴性质控品，用于检测过 程中试剂盒和仪器的质量控制。此外，每个样本均检测 1 个 内标，用于评估核酸提取和 PCR 扩增的质量和结果的判读。

(二) 生产工艺及反应体系研究

申请人对试剂盒反应体系的研究包括对 HBV-RNA 特异性 引物/探针浓度的确定、内标引物/探针浓度的确定、反应液 的选择、反应体积的确定、核酸提取试剂的确定、DNA 酶 I 的用量确定等；对反应条件的研究包括 PCR 退火温度、扩增 循环数、扩增反应时间，DNA 酶 I 的作用温度和时间的筛选 和优化；对样本用量、内标用量、核酸提取液体积等进行了 研究。 

申请人通过功能性实验，确定了最佳的反应体系。并根 据试剂盒中试剂及组件的主要生产工艺的研究结果，确定了 最佳的生产工艺。 

（三）分析性能评估 

该产品分析性能评估内容包括核酸提取功能、检出限、 线性范围、准确度、精密度、分析特异性（交叉反应、干扰 物质）、HBV DNA 干扰浓度等。申请人提交了有效运行的质 量 管 理 体 系 下 生 产 的 三 批 产 品 在 3 种 适 用 机 型 （ ABI  Prism7500、LightCycler480、杭州博日 9600plus）上的性能 评估资料。 

在核酸提取功能评估中，申请人使用含有 28mg/dL 总胆 红素、22g/dL 血红蛋白、3000mg/dL 甘油三酯、40g/L 总 IgG 的 HBV-RNA 阴性血清样本稀释已知浓度的 HBV-RNA 强阳 性样本，制备成高、低浓度样本进行研究，结果表明以上干 扰物质对核酸提取性能无影响。

在检出限的性能评估中，申请人对 HBV-RNA 临床血清 样本（B 型、C 型、D 型）和 HBV-RNA 假病毒样本（A 型、E 型、F 型、G 型）进行梯度稀释，采用三批次试剂对系列浓 度样本分别进行 20 次重复检测，以≥95%阳性检出率的最低 稀释浓度作为检出限，最终确定该产品检出限为 300copies/mL。采用三批试剂对 HBV-RNA 临床血清样本（B 型、C 型、D 型）和 HBV-RNA 假病毒样本（A 型、E 型、F 型、G 型）进行检出限的重复性检测验证，符合检出限的性 能要求。 

在线性范围的性能评估中，申请人采用不同基因型的样 本，分别制备 9 个浓度的样本进行线性范围研究，产品在 1.0 ×103 copies/mL~1.0×108 copies/mL 范围浓度呈线性相关， 线性相关系数 r＞0.9800，符合线性范围的性能要求。 

在准确度的性能评估中，申请人采用 HBV-RNA 阴性样本 对阳性样本进行系列稀释，分别制备成 2.0×107 copies/mL、 2.0 × 106 copies/mL 、 2.0 × 105 copies/mL 、 2.0 × 104 copies/mL、2.0×103 copies/mL 共 5 个梯度样本进行准确 度研究，结果表明检测浓度的对数值与理论浓度的对数值的 绝对偏差不超过±0.5 个对数数量级，符合准确度的性能要 求。 

在精密度的性能评估中，申请人对高、中 2 个浓度的 HBVRNA 精密度样本进行检测，分别对批内、批间检测结果进行分析，结果表明精密度样本的变异系数均不高于 5%，符合精 密度的性能要求。 

分析特异性研究包含交叉反应和干扰研究。交叉反应的 性能评估中，申请人对人巨细胞病毒、EB 病毒、人类免疫 缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、梅毒、人类疱疹 病毒 6 型、单纯疱疹病毒 1 型、单纯疱疹病毒 2 型、甲型流 感病毒、丙酸痤疮杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌样本 进行交叉反应评价。结果显示，上述样本与本产品均不产生 交叉反应。 

干扰研究实验中，申请人采用在中低浓度的 HBV-RNA 样 本中加入干扰物质的方法进行验证，拉米夫定（1.3μg/mL）、 阿德福韦酯（21.24ng/mL）、恩替卡韦（3.46μg/mL）、替 比夫定（3.69μg/mL）、普通 IFNα（2020pg/mL）、聚乙二 醇干扰素α（10.88μg/L）、总胆红素（≤28mg/dL）、甘油 三酯（≤3000mg/dL）、血红蛋白（≤22g/dL）、总 IgG（≤ 40g/L）及不高于 2×107 IU/mL 的 HBV DNA 对本产品检测结 果均不产生干扰。

（四）阳性判断值或参考区间研究 

本产品的阳性判断值研究，采用乙肝感染者的血清样本 （B 型、C 型、D 型）及不同人的阴性血清样本共 249 例， 使用本试剂盒进行阳性判断值研究，对检测靶标 Ct 值进行 ROC 分析，确定其阳性判断值为靶标 Ct≤26。通过对 HBVDNA 阳性/阴性、HBsAg 阳性/阴性及 HBeAg 阳性/阴性样本的 靶标进行 Ct 值分析，HBV DNA 阳性/阴性、HBsAg 阳性/阴性 及 HBeAg 阳性/阴性对靶标阳性判断值的判定无影响。 

本产品预测 HBeAg 转阴的阳性判断值研究，采用 79 例 慢性 HBV 感染者（B 型、C 型、D 型）队列血清样本（0 周、 48 周、5 年），使用本试剂盒进行检测，对检测结果分别计 算 B、C、D 型的 ROC 曲线和最佳预测 cutoff 值，结果显示 均不具有显著差异；将 B 型、C 型、D 型样本合并共同用于 确定预测治疗 5 年后 e 抗原转阴的最佳 cutoff 值为 708copies/mL。此时的 PPV 为 81.8%，NPV 为 87.0%。

（五）稳定性研究 

申请人对本产品的实时稳定性、开瓶及冻融次数限度稳 定性、运输稳定性进行了研究，同时，对样本的稳定性也进 行了研究，确定了在各种条件下本产品及样本的有效保存时 间。 

实时稳定性：将三批次试剂的 A 盒置于 10~30℃，B 盒 置于-20 ± 5℃的条件下保存，连续 7 个月对试剂盒的外 观、阴阳性符合率、检出限、线性、准确度、精密度进行考 察，各项性能指标均符合要求，确定产品在规定的储存条件 下，可稳定保存 6 个月。 

此外，申请人对产品的开瓶及冻融次数限度稳定性、运 输稳定性和样本稳定性分别进行了研究。结果显示，产品的性能均满足产品说明书声称的要求。

一、临床评价概述

申请人在首都医科大学附属北京佑安医院、兰州大学第 二医院、沈阳市第六人民医院共 3 家机构完成了临床试验， 对考核试剂检测人血清中 HBV-RNA 的临床准确性和临床有效 性进行验证。

( 一) 临床准确性验证 

采用考核试剂与参比方法对临床样本进行比较研究试验 的方法验证本产品的临床准确性。入组样本为慢性 HBV 感染 者、其他肝脏疾病干扰样本以及非肝脏疾病的正常人血清样 本，共计 1033 例。参比方法选择 ABI QuantStudio 3 D 芯 片数字 PCR 系统。 

临床准确性研究在 3 家临床单位共检测了 1033 例血清 样本，实际纳入检测 1033 例，包括慢性 HBV 感染者样本 709 例（68.64%），其他肝脏疾病干扰样本 78 例 （7.55%），非肝脏疾病的正常人样本 246 例（23.81%）； 675 例有分型结果的样本中，B 基因型 160 例、C 基因型 464 例、D 基因型 51 例。 

对 1033 例入组血清样本进行考核试剂和参比方法符合 率分析，阳性符合率 99.26%（95%CI：98.11% ~99.80%）、 阴性符合率 98.99%（95%CI：97.65% ~ 99.67%）、总体符 合率 99.13%（95%CI：98.35% ~ 99.60%）；Kappa（K）=0.983，考核试剂和参比方法具有较好的一致性。

相关性分析显示考核试剂和参比方法的线性相关系数 r=0.9864 ， 回 归 分 析 得 出 的 线 性 回 归 方 程 为 y=0.9854x+0.1123，其中截距 a 的 95%的置信区间为[0.0255， 0.1992]，斜率 b 的 95%的置信区间为[0.9693，1.0015]。

对 675 例有基因分型数据的样本检测结果进行分析。B 基因型血清样本，考核试剂与参比方法定量检测结果的相 关系数 r=0.9873，线性回归方程为 y = 0.9973x +  0.0083，截距 a 的 95%置信区间为[-0.1876，0.2042]，斜 率 b 的 95%置信区间为[0.9625，1.0321]；C 基因型血清样 本，考核试剂与参比方法定量检测结果的相关系数 r=0.9853，线性回归方程为 y = 0.9876x + 0.1229，截距 a 的 95%置信区间为[0.0161，0.2296]，斜率 b 的 95%置信区 间为[0.9672，1.0080]；D 基因型血清样本，考核试剂与参 比方法定量检测结果的相关系数 r=0.9918，线性回归方程 为 y = 1.0241x - 0.1546，截距 a 的 95%置信区间为[- 0.4375，0.1290]，斜率 b 的 95%置信区间为[0.9748， 1.0732]。考核试剂与参比方法的定量检测结果 （lgcopies/mL）之差在±0.5 范围内。

综上所述，申请人考核试剂与参比方法检测结果一致。 

( 二) 临床有效性研究  

本研究中分别对考核试剂定量检测血清 HBV-RNA 用于预测 NAs 治疗患者 HBeAg 转阴、HBV DNA 低浓度的 CHB 患者中 HBV-RNA 的检出率进行临床有效性研究。 

1.考核试剂定量检测血清 HBV-RNA 用于预测 NAs 抗病毒 治疗患者 HBeAg 转阴研究 

采用考核试剂对来源于回顾性队列样本的 78 个患者（接 受 NAs 抗病毒治疗的 HBeAg 阳性慢性 HBV 感染者）的共 624 例血清样本进行 HBV-RNA定量检测，每个患者采集 8个标本， 分别对应治疗前和治疗中的 8 个不同检测点：即 NAs 抗病毒 治疗第 0 周、24 周、48 周、1.5 年、2 年、3 年、4 年、5 年。 优选治疗第 48 周血清样本中的 HBV DNA、HBV-RNA 定量值用 于预测治疗五年后（一个治疗周期）HBeAg 转阴的受试者工 作特征曲线（ROC）分析和这些定量值对 HBeAg 转阴的预测值 分析。

分析结果显示，NAs 药物治疗的 78 例 HBeAg 阳性患者 中，治疗 48 周 HBV DNA 定量和 HBV-RNA 定量预测 NAs 药物 治疗五年后 HBeAg 转阴的曲线下面积（AUC）依次为 0.736 和 0.874。

HBV DNA 以 156.0 IU/mL 为阈值独立预测治疗 5 年 HBeAg 转阴的阳性预测值为 60.9%，阴性预测值为 84.4%；HBV-RNA 以 708 copies/mL 为阈值独立预测治疗 5 年 HBeAg 转阴的阳 性预测值为 80.6%，阴性预测值为 83.3%。HBV-RNA 在治疗 48 周后预测五年 HBeAg 转阴的预测价值优于血清 HBV DNA 的预测价值。 

2. HBV DNA 低浓度 HBV 感染者中 HBV-RNA 检出率研究 

本次临床试验共包含 374 例 HBV DNA 低浓度（＜500  IU/ml）或未检出样本，其中 HBV DNA 阴性 227 例。在 HBV  DNA 阴性样本中，HBV-RNA 检出阳性 145 例，阳性检出率为 63.88%（145/227）；在 374 例 HBV DNA＜500IU/mL 的慢性 HBV 感染者样本中，HBV DNA 检出阳性 147 例，阳性检出率 39.30%（147/374），HBV-RNA 检出阳性 249 例，阳性检出率 66.58%（249/374），χ2 =54.26，P＜0.05，具有显著差异。 可见在 HBV DNA 低浓度或未检出的慢性 HBV 感染者中，HBVRNA 具有较高的检出率。 

综上所述，临床试验结果显示本产品的临床性能满足技 术审评要求。 

四、产品受益风险判定 

(一 ) 受益评估 

本产品可用于对乙型肝炎病毒感染的辅助诊断，也可以 对 NAs 的治疗效果作出预测。我国乙型肝炎患者比较多， NAs 治疗可以提高乙型肝炎患者的治愈率，单独检测 HBV  DNA 可能存在漏检风险，研究表明，通过对 HBV DNA 已经 检测不到的患者进行 HBV-RNA 的检测，可以辅助对患者病 情进行监测。

(二 ) 风险评估 

该试剂盒已知和可预见的安全风险主要有以下几个方面： 

1. 与预期用途有关的安全风险，例如本产品的检测结果 非患者病情评价的唯一指标，未结合患者临床表现和其他实 验室检测对病情进行综合分析。 

2. 与生产有关的安全风险，例如使用未经过验证或检验 不合格的原材料。

3. 与运输与储存有关的安全风险，例如试剂的运输和储 存超出规定条件。 

4. 与使用有关的安全风险，例如使用仪器和试剂时没有 按照说明书要求进行操作。 

5. 生物危险，例如直接丢弃使用后或失效的产品或产 品使用过程中产生的废弃物未按照医疗废弃物统一销毁处理。 

通过对乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR- 荧光探针法）从生产原材料、配制、检测、包装、运输、储 存、使用方法及安全注意事项、保存和用后处理等全过程危 害判定、风险估计、预防化解，从产品技术要求和使用说明 书及企业规章制度对产品质量的全过程控制和风险防范措施， 已将产品的安全风险系数降到了验收准则规定的可接受范围 内，同时采取降低风险的措施后没有引入新的风险。在目前 认知水平上，认为该产品上市带来的受益大于风险。尽管目 前认为该试剂盒的受益大于风险，但是为保证用械安全，基 于对主要剩余风险的防控，已在该试剂盒说明书中提示以下信息：

1.预期用途： 

本试剂盒用于体外定量测定人血清样本中的乙型肝炎病 毒 RNA（HBV-RNA）。 

已有研究数据显示，外周血血清中 HBV-RNA 可反映肝内 HBV 病毒的转录活性，在部分血清中 HBV DNA 低于检测下限 的样本中，HBV-RNA 仍可以被检测到。同时，在 NAs 治疗中， 血清 HBV-RNA 可辅助作为 HBeAg 转阴的预测的指标之一，血 清 HBV-RNA 结果为阴性，需要结合其他指标共同用于指导 NAs 的治疗。该检测结果不得作为患者病情评价的唯一指标，必 须结合患者临床表现和其他实验室检测对病情进行综合分析。 本试剂盒不得用于 HBV 的血液筛查。

2.警示及注意事项： 

该试剂盒说明书中明确了该试剂盒检验方法的局限性及 注意事项。

综合评价意见

本申报项目为境内第三类医疗器械产品注册。申请人的 注册申报资料符合现行要求，依据《医疗器械监督管理条例》 （国务院令第 680 号）、《体外诊断试剂注册管理办法》（原 国家食品药品监督管理总局令第 5 号）等相关医疗器械法规 与配套规章，经系统评价后，建议准予注册。 

2022 年 11 月 10 日