人类 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化联合 检测试剂盒(荧光 PCR 法)体外诊断试剂产品注册技术审评报告

体外诊断试剂产品注册技术审评报告 

产品中文名称：人类 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化联合 检测试剂盒(荧光 PCR 法)

产品管理类别：第三类 

申请人名称 ：上海锐翌生物科技有限公司 

国家药品监督管理局 

医疗器械技术审评中心

目 录 

基本信息..........................................................................................................3 

一、申请人名称..............................................................................................3 

二、申请人住所..............................................................................................3 

三、生产地址..................................................................................................3 

技术审评概述..................................................................................................4 

一、产品概述..................................................................................................4 

二、临床前研究概述......................................................................................6 

三、临床评价概述........................................................................................12

四、产品受益风险判定................................................................................13 

综合评价意见................................................................................................16

基本信息 

一、申请人名称 

上海锐翌生物科技有限公司 

二、申请人住所 

上海市闵行区新骏环路 138 号 6 幢 202-3、302 室 

三、生产地址 

上海市闵行区新骏环路 138 号 6 幢 202-3、302 室；上海市闵 行区新骏环路 245 号 E 幢 6 层 616

技术审评概述 

一、产品概述 

（一）产品主要组成成分 

表 1 试剂盒主要组成成分

具体内容详见产品说明书。 

（二）产品预期用途 

本产品用于体外定性检测人粪便样本中肠道脱落细胞的 SFRP2 和 SDC2 基因的甲基化。本试剂盒适用于临床医生建议做肠 镜检查的患者的辅助诊断，不能作为肿瘤早期诊断或确诊的依据， 检测结果仅供临床参考。临床医生应结合患者病情及其他实验室检 测指标等因素对检测结果进行综合判断。 

基因 DNA 高度甲基化是结直肠癌发生发展中的一个早期事件。 SFRP2 基因（分泌型卷曲相关蛋白 2）是 SFRP 家族一员，包含富集半胱氨酸的结构域，该结构域与卷曲蛋白 Wnt 结合位点同源。 SFRPs 主要作用于 Wnt 信号通路，是可溶的调节因子。SFRP2 基 因甲基化可以在结直肠癌组织、腺瘤组织以及异常隐窝病灶中检测 到，但正常结直肠粘膜组织中，SFRP2 基因都是未甲基化的。粪便 DNA 中 SFRP2 甲基化，从正常人群到增生性息肉到腺瘤患者，是 显著增加的，表明粪便 DNA 中 SFRP2 基因甲基化可能是潜在的非 侵入性的结直肠癌诊断标志物。SDC2 基因编码人源长重组蛋白， 多篇临床研究报道表明SDC2基因启动子区域甲基化可能对结直肠 癌病变产生预示。实验操作人员应接受过基因扩增或分子生物学方 法检测的专业培训，具备相关的实验操作资格，实验室应具备合理 的生物安全防备设施及防护程序。

（三）产品包装规格 

48 人份/盒 

（四）产品检验原理 

基于荧光定量 PCR 原理，针对结直肠癌特异的 SFRP2 基因转 录本 NM_003013.2 上 0~200 位点范围内设计了甲基化特异 PCR 扩 增引物（MSP）以及匹配的 Taqman MGB 甲基化特异探针，覆盖 10 个以上 CpG 二联体位点。同时针对结直肠癌特异的 SDC2 基因 转录本 NM_002998.3 上 300~500 范围内设计了甲基化特异 PCR 扩 增引物（MSP）以及匹配的 Taqman MGB 甲基化特异探针，覆盖 7 个 CpG 二联体位点。构建了 SFRP2 基因和 SDC2 基因甲基化检测 反应体系以及内参基因β-actin 基因反应体系，使用 FAM 通道收集反应体系中待检测模板 SFRP2 基因和 SDC2 基因的扩增荧光信号， 使用 VIC 通道收集反应体系中待检测模板β-actin 基因的扩增荧光 信号。 

粪便样本人源 DNA 提取，使用核酸提取试剂盒（上海锐翌生 物科技有限公司生产，备案号：沪闵械备 20180535 号）。甲基化 DNA 的亚硫酸盐转化，使用核酸纯化试剂盒（上海锐翌生物科技 有限公司生产，备案号：沪闵械备 20180536 号）。

将纯化试剂盒获得的 DNA 作为模板，进行甲基化 PCR 扩增， 在含有不同水平甲基化模板的情况下，甲基化 PCR 反应体系中对 应甲基化水平的反应得以正常进行并释放荧光信号，继而对样本甲 基化水平进行分析及判读，内参基因的检测用于评估样本人源 DNA 提取质量、甲基化转化质量和 PCR 扩增效果，确保甲基化基 因扩增的可靠性。 

试剂盒同时设置了阳性对照、阴性对照和空白对照，需要在每 一批试验同时检测，确保本次试验的有效性。

二、临床前研究概述 

（一）主要原材料 

1.主要原材料的选择 

本产品的主要原材料包括 dNTP、引物、探针、Taq 酶。这些 原材料均是通过外购的方式获得。

其中引物、探针的序列由申请人自行设计，由合成公司经过合 成、修饰、纯化方式获得；Taq 酶由原材料供应商克隆表达后获得；dNTP 由供应商化学合成获得。 

申请人对主要原材料进行了供应商的选择，通过功能性实验筛 选出合格供应商，制定了各主要原材料的技术要求和质量标准并经 检验合格。 

2.企业参考品和质控品设置情况 

本产品企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、精密度参考 品以及最低检测限参考品。

企业参考品的主要原材料为粪便样本、人甲基化全基因组 DNA 和人非甲基化全基因组 DNA。其中人甲基化全基因组 DNA 包括 SFRP2 基因和 SDC2 基因甲基化，人非甲基化全基因组 DNA 中 SFRP2 基因和 SDC2 基因相应位点均未发生甲基化。粪便样本 均为临床来源，同时 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化状态经过 Sanger 测序方法验证。 

阳性参考品包括 7 种，分别命名为阳性参考品 P1~P7。其中 P1~P3 为结直肠癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者粪便样本；P4~P7 为按照 比例配制的人甲基化全基因组 DNA 与人非甲基化全基因组 DNA 的混合样本。

阴性参考品包括 8 种，分别命名为 N1~N8，其中 N1~N3 为非 肠癌患者粪便样本；N4~N7 为分别掺入不同干扰物质的健康人粪 便样本；N8 为人非甲基化全基因组 DNA 样本。 

精密度参考品包括 2 种，命名为精密度参考品 J1 和 J2，为不 同比例的人甲基化全基因组 DNA 与人非甲基化全基因组 DNA 的混合样本。 

最低检测限参考品 1 种，命名为 L，为一定比例的人甲基化全 基因组 DNA 与人非甲基化全基因组 DNA 的混合样本。 

本试剂盒同时设置了阳性对照、阴性对照和空白对照，用于检 测过程中试剂和仪器的质量控制。此外，每个样本均检测内参基因 β-actin，用于结果的判读及评估样本的质量。

（二）生产工艺及反应体系研究 

申请人对试剂盒反应体系的研究包括引物探针浓度的确定、 Taq 酶用量的确定、Mg 2+浓度的确定、dNTP 浓度的确定、DTT 浓 度的确定、单/双重反应体系的对比验证等；对 PCR 反应条件的研 究包括 qPCR 延伸时间的确定和扩增循环数的优化；对样本的用量 以及样本保存时间进行了研究。 

通过功能性实验，最终确定了最佳的反应体系。申请人根据试 剂盒中试剂及组件的主要生产工艺的研究结果，确定了最佳的生产工艺。

（三）分析性能评估 

本产品分析性能评估内容包括准确度、最低检测限、精密度、 分析特异性、核酸提取试剂及核酸纯化试剂性能研究，同时对粪便 样本稳定性、粪便样本提取核酸稳定性及粪便样本转化后核酸稳定 性进行了研究。 

准确度研究中，选择了若干例临床粪便样本进行研究，得出灵 敏度为 92.86%，特异性为 100%，符合率为 95%。腺瘤样本准确度研究中，选择 57 例腺瘤粪便样本（其中 31 例高级别上皮内瘤变样 本，26 例结直肠腺瘤样本）使用三个批次的人类 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化联合检测试剂盒(荧光 PCR 法)进行检测，并通过 Sanger 测序对样本 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化状态进行验证。研究结果 显示，高级别上皮内瘤变样本的阳性检出率为 51.61%。Sanger 测 序和试剂盒检测 SFRP2 基因、SDC2 基因甲基化结果一致性均为 100%。

最低检测限研究，以阴性粪便为基质，采用模拟样本和临床阳 性稀释样本，使用三个批次的人类 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化联 合检测试剂盒(荧光 PCR 法)分别进行最低检测限的建立和验证。明 确了试剂盒的最低检测限为 10ng 人基因组 DNA 背景下，1%的 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化。

精密度研究通过不同地点、人员、轮次、日间和批次对弱阳性 粪便样本及阴性粪便样本进行连续 20 天精密度研究，人类 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化联合检测试剂盒（荧光 PCR 法）检测结果变 异系数均小于 10%。

分析特异性研究包含交叉反应研究和干扰研究，交叉反应研究 包括其它消化道肿瘤常见的甲基化基因、转化前结直肠癌粪便样本、 其他消化道肿瘤粪便样本、其他粪便中常见非人源性样本、其他粪 便中常见病原体。干扰研究包括内、外源性干扰物质和粘液便样本 干扰研究。

其它消化道肿瘤常见的甲基化基因交叉反应研究中，通过对其它消化道肿瘤常见的甲基化基因 BMP3、NDRG4、Septin9、SOX17 和 TFPI2，分别采用三个不同批次的人类 SFRP2 和 SDC2 基因甲基 化联合检测试剂盒（荧光 PCR 法）进行交叉反应研究，结果显示 本产品能够实现对 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化的特异性检测。 

转化前结直肠癌粪便样本研究中，使用三个批次的人类 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化联合检测试剂盒(荧光 PCR 法)分别检测转化前、 后结直肠癌粪便样本 DNA，结果显示本产品能够实现对 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化的特异性检测。

交叉反应研究中，使用三个批次的人类 SFRP2 和 SDC2 基因 甲基化联合检测试剂盒(荧光 PCR 法)检测常见的其他消化道肿瘤 粪便样本包括食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌和胰腺癌共 5 种恶性肿 瘤，结果显示该产品与食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌和胰腺癌均无 交叉反应。 

粪便中常见非人源性物质的特异性研究显示，粪便中含有以下 常见非人源性物质：牛血红蛋白（0.5mg/mL）、猪血红蛋白 （0.5mg/mL），牛肉（0.5μg/mL）、羊肉（0.5μg/mL）、鱼肉（0.5μg/mL）、 菠菜（0.5μg/mL）、白菜（0.5μg/mL）、金针菇（0.5μg/mL）、玉米 （0.5μg/mL）、青椒（0.5μg/mL），这 10 种非人源物质对本试剂盒 检测结果均没有影响。

粪便中常见病原体的特异性研究显示，粪便中含有以下常见病 原体：大肠杆菌(2.5×10 5CFU/mL)、屎肠球菌(2.5×10 5CFU/mL)、粪 肠球菌(2.5×10 5CFU/mL)、铜绿假单胞菌(2.5×10 5CFU/mL)、金黄色葡萄球菌(2.5×10 5CFU/mL)对本试剂盒检测结果均没有影响。 

干扰物质研究显示，粪便中含有不超过 0.288mg/g 的胆红素、 3.75mg/g 的盐酸吉西他滨、0.475mg/g 的苯丁酸氮芥、1.75mg/g 的 人血红蛋白对本试剂盒的检测结果没有影响。

粘液便干扰研究显示，粪便样本的粘液性状对本试剂盒的检测 结果没有影响。 

申请人采用临床粪便样本进行了核酸提取试剂性能研究和核 酸纯化试剂性能研究，并根据与该产品的组合性能研究结果，确定 推荐的核酸提取试剂和核酸纯化试剂符合检测要求。

（四）阳性判断值或参考区间研究 

本产品阳性判断值的研究采用临床来源粪便样本。阳性判断值 研究入组（包括建立和验证）有效样本数共计 554 例，包括结直肠 癌患者样本、结直肠腺瘤样本、结直肠息肉样本、结直肠炎症样本、 肠道未见明显异常样本等。β-actin 基因的 Ct 值≤38.5 时判定为样 本有效。通过逻辑回归方程建立 Score 值计算公式，采用 ROC 曲 线和约登指数确定试剂盒的阳性判断值为 20。当 Score 值＜20 时， 样本的检测结果为阴性；当 Score 值≥20 时，样本的检测结果为 阳性。

阳性判断值验证结果显示：灵敏度为 93.40%，特异性为 95.24%，总符合率为 94.75%。

（五）稳定性研究 

申请人对该产品的稳定性研究包括货架效期稳定性、运输稳定性、使用稳定性（包括开瓶稳定性、冻融稳定性）及样本稳定性（包 括粪便、粪便提取 DNA 及粪便提取转化后 DNA 的稳定性）。 

货架有效期稳定性：将三批次试剂盒置于-20±5℃储存条件下 放置 0、3、6、9、12、14 个月，每到一个时间节点使用企业参考 品对试剂盒的性能进行检测，结果显示试剂盒在生产后保存至 14 个月各项性能指标均符合产品技术要求，产品有效期可达 12 个月。

此外，申请人对产品的运输稳定性、使用稳定性和样本稳定性 分别进行了研究。结果显示，产品的性能均满足产品说明书的声称。

三、临床评价概述 

本产品在中国人民解放军总医院第七医学中心、蚌埠医学院第 一附属医院、南京大学医学院附属鼓楼医院和山西省肿瘤医院四家 临床试验机构进行临床试验，采用试验体外诊断试剂与临床参考标 准进行比较研究，确认本产品的临床性能。其中，结直肠癌和其他 肿瘤病例采用病理诊断确诊，其他疾病根据相关诊疗指南进行综合 诊断确诊。入组病例为结直肠癌疑似病例，样本类型为粪便。产品 临床灵敏度和特异度评价共纳入临床有效病例 1235 例，其中结直 肠癌病例 435 例（覆盖结直肠癌所有分期及病理分型），非结直肠 癌的其他病例 800 例（包括其他易产生干扰的肿瘤及各种良性疾病 病例）。试验结果显示：本产品临床灵敏度为 92.2%（95%CI：89. 3%～94.4%），特异度为 91. 9%（95%CI：89.8%～93.6%），总符合 率为 91.9%（95%CI：90.3%～93.4%）。上述结果显示试验体外诊 断试剂具有较好的临床灵敏度和特异度，满足临床使用需求。

此外，临床试验还纳入 279 例结直肠癌疑似病例，采用试验体 外诊断试剂与一代测序进行比较研究，确认本产品的临床检测性能。 试验结果显示：针对 SFRP2 基因，阳性符合率为 100%（95%CI： 96.5%～100%），阴性符合率为 100%（95%CI：97.8%～100%）， 总符合率为 100%（95%CI：98.6%～100%）；针对 SDC2 基因，阳 性符合率为 100%（95%CI：96.6%～100%），阴性符合率为 100% （95%CI：97.8%～100%），总符合率为 100%（95%CI：98.6%～ 100%）。上述结果显示两者之间具有良好的一致性，本产品临床检 测性能满足要求。

综上所述，临床试验结果显示本产品的临床性能满足技术审评要求。

四、产品受益风险判定 

根据 YY/T 0316-2016《医疗器械 风险管理对医疗器械的应用》 对人类 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化联合检测剂盒（荧光 PCR 法） 进行产品受益风险判定。 

（一）受益评估 

该产品适用于临床医师建议做肠镜检测的患者的辅助诊断，不 能作为肿瘤早期诊断或确诊的依据，检测结果仅供临床参考，具体 临床应用时，临床医生必须结合病例实际情况判断。其临床应用的 主要受益在于：该产品为临床医师建议做肠镜检测的患者提供一种 结直肠癌辅助诊断方法的选择。检测结果为阳性患者体内有结直肠 癌或高级别上皮内瘤变的可能性大，从而促进这部分人群顺应肠镜检查，获得及时的诊断和治疗。通过 4 家中心 1235 例临床试验证 实，本试剂盒对结直肠癌的灵敏度为 92.2%（95%CI：89. 3%～ 94.4%），除腺瘤外非结直肠癌的特异性为 95.8%（95%CI：94.0%～ 97.2%），对高级别上皮内瘤变的检出率为 62.9%（95%CI：44.9%～ 78.5%）。

（二）风险评估 

该试剂盒已知和可预见的安全风险主要有以下几个方面： 

1.与预期用途有关的安全风险，例如本产品的检测结果非唯一 诊断依据，医生未结合其他诊断方法进行综合诊断。阳性结果不能 作为确诊依据，阴性结果也不能作为排除的依据。

2.与生产有关的安全风险，例如原材料未经过工艺验证。 

3.与储存或运输相关的风险，例如在不正确的储存和运输条件 下储存、运输试剂盒。 

4.与使用有关的风险，例如使用仪器和试剂时没有按照说明书 要求进行操作。

5.生物危险，例如使用后或失效的产品直接丢弃或产品使用过 程中产生的废弃物未按照要求按医疗废弃物统一销毁处理。

通过对人类 SFRP2 和 SDC2 基因甲基化联合检测试剂盒（荧 光 PCR 法）从生产原材料、配制、检测、标识、包装、运输、储 存、使用方法及安全注意事项、保存和用后处理等全过程危害判定、 风险估计、预防化解，从产品技术要求和使用说明书及企业管理制 度对产品质量的全过程控制和风险防范措施，已将产品的安全风险系数降到了接收准则规定的可接受范围内,同时采取降低风险的措 施后没有引入新的风险。在目前认知水平上，认为该产品上市带来 的受益大于风险。 

尽管目前认为该试剂盒的受益大于风险，但为保证用械安全， 基于对主要剩余风险的防控，已在该试剂盒说明书中提示以下信息：

1.预期用途： 

本产品用于体外定性检测人粪便样本中肠道脱落细胞的 SFRP2 和 SDC2 基因的甲基化。本试剂盒适用于临床医生建议做肠 镜检查的患者的辅助诊断，不能作为肿瘤早期诊断或确诊的依据， 仅作为辅助诊断供临床医生参考，提供给患者更多一种结直肠癌辅 助诊断方法的选择。临床医生应结合患者病情及其他实验室检测指 标等因素对检测结果进行综合判断。 

2.警示及注意事项：

该试剂盒说明书中明确了该试剂盒检验方 法的局限性及使用中的注意事项。

综合评价意见 

本申报项目为境内第三类医疗器械产品注册，属于境内同品种 首个产品。申请人的注册申报资料符合现行要求，依据《医疗器械 监督管理条例》（中华人民共和国国务院令 第 739 号）、《体外诊断 试剂注册管理办法》（原国家食品药品监督管理总局令 2014 年第 5 号）等相关医疗器械法规与配套规章，经系统评价后，建议准予 注册。 

2022 年 5 月 10 日