NTRK1_NTRK2_NTRK3基因融合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）（CSZ2400118）

受理号：CSZ2400118

体外诊断试剂产品注册技术审评报告

产品中文名称：NTRK1/NTRK2/NTRK3 基因融合检测试剂盒

（可逆末端终止测序法）

产品管理类别：第三类

申请人名称 ：南京世和医疗器械有限公司

国家药品监督管理局  医疗器械技术审评中心

目  录

基本信息 3

一、申请人名称 3

二、申请人住所  3

三、生产地址  3

技术审评概述  4

一、产品概述 4

二、临床前研究概述  6

三、临床评价概述  10

四、产品受益风险判定 12

综合评价意见  14

基本信息

一、申请人名称

南京世和医疗器械有限公司

二、申请人住所

南京市江北新区华康路 128 号 A 座 6 层

三、生产地址

南京市浦口区华康路 128 号一期 A 栋 6 层、B 栋 B245-B261 室

技术审评概述

一、产品概述

（一）产品主要组成成分

主要组成成分如下：

注 1：同一组分不同批号不能混用。注 2：PCA 为 Pan-Cancer 缩 写。

（二）产品预期用途

本试剂盒用于体外定性检测实体瘤患者福尔马林固定的石 蜡包埋（FFPE）组织样本中 NTRK1/NTRK2/NTRK3 基因融合变异， 用于 NTRK 抑制剂恩曲替尼的伴随诊断。

本试剂盒检测结果仅供临床参考，不应作为医生决策的唯 一依据。临床医生应综合患者临床多种情况综合判定。

（三）产品包装规格

12 人份/盒；24 人份/盒；36 人份/盒。

（四）产品检验原理

本试剂盒采用 DNA 探针捕获技术：首先对从肿瘤FFPE 样 本中提取的核酸（DNA）进行片段化、加接头及 PCR 扩增等制 备文库。其后采用具有特定序列的 DNA 探针与文库进行杂交， 从而特异性捕获探针目标区域 DNA 片段，包含人类基因组多种

基因中的外显子区域、内含子区域；再通过磁珠法对这些片段 进行富集。在对捕获富集后的文库进行定量与质控后，采用基 因测序仪进行高通量测序。对于测序数据，采用生物信息学软 件分析判读样本中是否含有试剂盒检测基因的相关变异。

本试剂盒包含阴、阳性对照品，用于检测过程中试剂和仪器 的质量控制。

二、临床前研究概述

（一）主要原材料

1.主要原材料的选择

该产品的主要原材料包括：富集探针、末端修复酶、连接酶、 DNA 聚合酶、接头、PCR 扩增引物、链霉亲和素磁珠、细胞系 DNA 等，这些原材料均为外购方式获得。

其中富集探针为申请人自行设计后由专业的合成公司合成 并纯化获得。细胞系 DNA 由供应商提取纯化获得。

申请人对主要原材料进行了供应商的选择，通过功能性试 验，筛选出合格供应商，制定了各主要原材料的技术要求和质 量标准并经检验合格。

2.企业参考品和质控品的设置情况

企业参考品包括：阳性参考品、阴性参考品、最低检测限参 考品和重复性参考品。

其中阳性参考品 2 份，包括 NTRK1 、NTRK2 、NTRK3 基 因不同融合、不同突变丰度混合样本；阴性参考品 1 份为检测 范围内所有标注位点均无变异样本；最低检测限参考品 1 份， 为检测范围内检出限水平 NTRK1 、NTRK2 、NTRK3 基因融合 混合样本。重复性参考品 3 份，包括前述阳性参考品和阴性参 考品。

该产品设置了阴性对照品及阳性对照品，其中阳性对照品 包含 NTRK1/NTRK2/NTRK3 基因融合阳性位点，阴性对照品为 健康人细胞系 DNA，用于检测过程中试剂和仪器的质量控制。

（二）生产工艺及反应体系研究

申请人根据试剂盒中试剂及组分的主要生产工艺的研究结 果，确定了最佳的生产工艺。

申请人对产品反应体系的研究包括文库构建条件、质控标 准、接头浓度、封闭序列浓度、探针浓度、文库富集条件、测序 反应条件等进行筛选和优化，通过功能性试验，最终确定了最 佳的反应体系。

（三）分析性能评估

分析性能评估内容包括准确性、最低检测限、精密度、分析 特异性、组织样本肿瘤细胞含量、核酸提取纯化性能等研究。申 请人提交了有效运行的质量管理体系下生产的三批产品，在适

用机型上进行的分析性能评估资料。

准 确 性 研 究 中 ， 对 含 有 不 同 丰 度 水 平 NTRK1/NTRK2/NTRK3 基因融合的 FFPE 临床样本和阴性临床 样本进行检测，临床样本涵盖不同人体肿瘤系统，研究结果显 示试剂盒检测结果与全外显子组测序结果的阳性符合率和阴性 符合率均为 100%。

最低检测限研究中，首先对含有 NTRK1/NTRK2/NTRK3 基 因融合的样本按照不同丰度比例进行稀释，初步确定检测限。

再选取肿瘤细胞含量为 20%，NTRK1/NTRK2/NTRK3 基因融合  变异丰度低至 2%的临床样本，临床样本涵盖不同人体肿瘤系统， 使进行 20 次重复检测进行验证，检出率≥95%的最低浓度水平  确定为最低检测限。最终确定本产品最低检测限为在肿瘤细胞  含量不低于 20%，50ngFFPEDNA 中，融合变异频率低至 2%。

精 密 度 研 究 中 ， 对 含 有 不 同 丰 度 水 平 NTRK1/NTRK2/NTRK3 基因融合的 FFPE 临床样本和阴性临床 样本进行检测，临床样本涵盖不同人体肿瘤系统。结果显示本 产品批次内/间、日内/日间、不同操作者间、不同仪器及不同实 验室间的精密度良好，符合预期要求。申请人对 10 例临床样本 综合上述精密度研究数据进行分析，评价探针区域覆盖均一性， 结果显示本产品探针覆盖均一性良好。

分析特异性包含交叉反应研究及干扰物质研究。交叉反应 研究包括常见感染微生物、检测范围外变异类型、高浓度基因 组，结果显示与本产品均不产生交叉反应。干扰因素研究结果 显示，临床 FFPE 样本可能存在的干扰物酒精（ 1%V/V）、福尔 马林（0.005%V/V）、石蜡（ 1%V/V）、血红蛋白（2g/L）、甘油 三酯（3mg/mL）、蛋白酶 K（0.08mg/mL）、坏死组织（50%V/V）， 对检测结果均无影响。

组织样本肿瘤细胞含量研究，将不同肿瘤细胞含量对检测 结果的影响进行了研究。结果表明，肿瘤细胞含量 10%以上的 组织样本均可检出。结合临床样本的多样性和复杂性，建议组 织样本肿瘤细胞含量≥20%。

针对核酸提取、纯化步骤，申请人采用临床样本，根据与产 品的组合性能研究结果，确定配套的核酸提取试剂和核酸纯化 试剂符合检测要求。

（四）阳性判断值研究

申请人采用 ROC 曲线法确定阳性判断值。申请人选取 328 例实体瘤临床样本进行检测，研究样本涵盖不同人体肿瘤系统 和 NTRK1 、NTRK2 、NTRK3 基因，包含目标高频融合和部分 低频融合类型。选择参考方法作为研究对比方法，通过 SPSS 软 件进行 ROC 曲线分析，确定本产品的阳性判断值。最终确定阳

性判断值为： 当嵌合 reads 数≥4 时，则该位点为突变阳性；反 之，则判断为阴性。

（五）稳定性研究

申请人进行的稳定性研究，包括实时稳定性、使用稳定性 （开瓶和冻融稳定性）、运输稳定性等。

实时稳定性研究采用 3 批试剂盒置于规定储存条件下放置 0 月、3 月、9 月、10 月、11 月，每到一个时间节点使用企业参 考品对试剂盒的性能进行检测，结果显示试剂盒在生产后保存 至 11 个月各项性能指标均符合产品技术要求，结果表明：产品 在-20℃±5℃条件下保存（磁珠于2~8℃条件下保存）有效期可 达 10 个月。

此外，样本稳定性和试剂运输及使用稳定性研究结果支持 说明书声称。

三、临床评价概述

申请人在中国医学科学院肿瘤医院、安徽省立医院、青岛大 学附属医院、哈尔滨医科大学附属肿瘤医院、浙江省肿瘤医院、 四川省肿瘤医院、辽宁省肿瘤医院共 7 家临床机构完成了临床 检测性能的研究， 同时通过桥接试验的方式在药物临床试验期 间完成了伴随诊断意义的研究。本次临床试验分为两部分：

第一部分：采用试验体外诊断试剂与临床参考方法全外显

子组测序进行对比试验，评价试验体外诊断试剂的临床检测性 能。

针对该部分研究，共纳入 2422 例病例，均为实体瘤患者， 样本类型为 FFPE 样本。其中 NTRK 基因融合阳性共 101 例， 包括 NTRK1 基因融合阳性 44 例、NTRK2 基因融合阳性 7 例、 NTRK3 基因融合的阳性 50  例。试验结果显示： 阳性符合率 98.02%(95%CI:93.07%,99.46%)，阴性符合率 99.74%(95%CI： 99.44%，99.88%)，总符合率为 99.67%(95%CI：99.35%,99.83%) 。 以上结果显示，试验体外诊断试剂与对比方法具有较好的一致 性。

第二部分：采用桥接研究，评价试验体外诊断试剂对于恩曲 替尼药物的伴随诊断性能。

针对该部分研究，采用本产品与 CTA 进行一致性研究，共 入组药物临床试验中的病例 67 例样本，均为阳性样本。同时申 请人补充入组了 157 例实体瘤患者的阴性 FFPE 样本，采用 CTA 的方法进行检测。试验结果显示：试验体外诊断试剂与 CTA 的 阳性符合 率 为 92.54%(95%CI:83.69%,96.77%) ， 阴性符合 率 99.36%(95%CI:96.48%,99.89%)，总符合率为 97.32%(95%CI： 94.28%,98.77%)。以上结果显示，试验体外诊断试剂与 CTA 具 有较好的一致性。

另外，针对药物临床试验纳入的 242 例NTRK 基因融合阳 性的 FFPE 组织样本，本次桥接试验纳入 67 例，试验体外诊断 试剂检测阳性 62 例。对于药物临床试验中的主要评价指标，纳 入桥接试验病例的客观缓解率（ORR）为 71.0%（95%CI：58.1% ， 81.8%），与药物临床试验结果基本一致；同时，针对 CTA 检测 阴性但试验体外诊断试剂检测阳性的病例进行了敏感性分析， 药物疗效无显著差异。

综上，临床试验资料符合技术审评要求。

四、产品受益风险判定

本公司参照 YY/T 0316-2016 《医疗器械 风险管理对医疗 器械的应用》对医疗器械产品的安全风险进行了分析。

（ 一）受益评估

本试剂盒用于定性检测实体瘤患者福尔马林固定的石蜡包 埋（FFPE）组织样本中 NTRK1/NTRK2/NTRK3 基因融合变异， 用于 NTRK 抑制剂恩曲替尼的伴随诊断。

本产品临床应用的主要受益在于：可以作为恩曲替尼的伴 随诊断试剂，对靶向用药人群进行筛选，从而让实体瘤患者获 得及时的治疗。

（二）风险评估

该试剂盒检测结果会受到样本来源、样本采集过程、样本运

输条件等样本因素的影响，同时也受到实验操作、实验环境、试  剂储存等试验因素的影响，可能导致数据质量降低或检测失败。 使用者须了解检测过程中可能存在的潜在风险及检测的局限性， 严格按照产品说明书中的要求进行操作和实验质控。

尽管目前认为该产品的获益/收益大于风险，但为保证用械 安全，基于对主要剩余风险的防控， 已在产品说明书中提示以 下信息：

1.  预期用途：本试剂盒用于定性检测实体瘤患者福尔马林 固定的石蜡包埋（FFPE）组织样本中 NTRK1/NTRK2/NTRK3 基 因融合变异，用于 NTRK 抑制剂恩曲替尼的伴随诊断。

本试剂盒检测结果仅供临床参考，不应作为医生决策的唯 一依据。临床医生应综合患者临床多种情况综合判定。

2.  警示及注意事项：该试剂盒说明书中明确了该试剂盒检 查方法的局限性及使用中的注意事项。

综合评价意见

本申报项目为境内第三类体外诊断试剂产品注册，依据《医 疗器械监督管理条例》（国务院令第 739 号）、《体外诊断试剂注 册与备案管理办法》（国家市场监督管理总局令第 48 号）等相 关医疗器械法规与配套规章，经对申请人提交的注册申报资料 进行系统评价，申报产品符合安全性、有效性的要求，符合现有 认知水平，建议准予注册。

2025 年 10 月 24  日

附件：产品说明书

附件

NTRK1/NTRK2/NTRK3 基因融合检测试剂盒

（可逆末端终止测序法）

说明书

【产品名称】

NTRK1/NTRK2/NTRK3 基因融合检测试剂盒（可逆末端终止 测序法）

【包装规格】

12 人份/盒；24 人份/盒；36 人份/盒 【预期用途】

本试剂盒用于体外定性检测实体瘤患者福尔马林固定的石蜡包 埋（FFPE）组织样本中 NTRK1/NTRK2/NTRK3 基因融合变异，用 于 NTRK 抑制剂恩曲替尼的伴随诊断。

本试剂盒检测结果仅供临床参考，不应作为医生决策的唯一依 据。临床医生应综合患者临床多种情况综合判定。

神经营养性受体酪氨酸激酶（NTRK）是负责编码原肌球蛋白相 关激酶（Trk）的基因，有 NTRK1、NTRK2、NTRK3 三个家族成员， 分别位于染色体 1q22、9q21 、15q25，编码家族蛋白 TrkA、TrkB 和 TrkC[1,2] 。NTRK1/2/3  基因融合是一种致癌驱动因子:染色体内或染 色体间的重排会导致 NTRK1/2/3 基因融合，进而驱动肿瘤细胞的增 殖与扩散。NTRK1/2/3 基因融合是一类重要的肿瘤发生驱动因素， 在实体瘤中的发生率约为 0.30%[3,4]。2022 年，NTRK 抑制剂拉罗替 尼（Larotrectinib ，LOXO-101）与恩曲替尼（Entrectinib）相继在中 国获批，用于治疗 NTRK 基因融合阳性的实体瘤患者。此外，多款 NTRK 抑制剂正在开发中，用于治疗 NTRK 基因融合阳性实体瘤患 者。由于 NTRK1/2/3 基因融合阳性患者可以从 NTRK 抑制剂治疗中 获益，因此，实体瘤患者在考虑进行 NTRK 抑制剂靶向治疗时，需 要对 NTRK1/2/3 的融合状态进行检测。目前，NTRK1/2/3 基因融合

突变最受认可的检测方法为高通量测序（NGS）。 【检验原理】

本试剂盒采用 DNA 探针捕获技术：首先对从肿瘤 FFPE 样本中 提取的核酸（DNA）进行片段化、加接头及 PCR 扩增等制备文库。 其后采用具有特定序列的 DNA 探针与文库进行杂交，从而特异性 捕获探针目标区域 DNA  片段，包含人类基因组多种基因中的外显 子区域、内含子区域；再通过磁珠法对这些片段进行富集。在对捕 获富集后的文库进行定量与质控后，采用基因测序仪进行高通量测 序。对于测序数据，采用生物信息学软件分析判读样本中是否含有 试剂盒检测基因的相关变异。

下图为本试剂盒检测步骤简表。本试剂盒包含阴、阳性对照品， 用于检测过程中试剂和仪器的质量控制。

图 1  试剂盒检测步骤示意图

【主要组成成分】

注 1：同一组分不同批号不能混用。注 2 ：PCA 为 Pan-Cancer 缩写。 本试剂盒不包含，但配套使用的试剂和软件如下：

【储存条件及有效期】

1.    本试剂盒于-20℃±5℃条件下保存（磁珠于 2~8℃条件下保存） 有效期为 10 个月。

2.    试剂盒反复冻融次数不超过 4 次，开封使用后应尽快用完。

3.    生产日期及有效期至：见标签 【适用仪器】

基因测序仪（型号：NextSeq550 Dx），Illumina 公司生产。 【样本要求】

1.   保存年限不超过 6 年的 FFPE 样本均可使用本试剂盒检测。样本  必须按照标准的病理学方法进行处理和保存，以确保样本的质量。 组织样本中肿瘤细胞占比应达 20%及以上。

2.   提取后的 DNA 总量应不少于 50ng。提取后的样本 DNA，如不 立即进行后续实验，可在-20±5℃保存 6 年。

3.        文库若不能立即富集，可在-20±5℃保存 30 天。

4.        富集文库若不能立即上机测序，可在-20±5℃保存 30 天。

【检验方法】

1.    样本制备

1.1      样本要求：石蜡包埋组织（白片/蜡块）：

a.     用刀片修整组织周围多余的石蜡。修片，直至切出完整的组织。

b.    切片厚度调至 5-10μm，手术组织需切取 2-8 张，穿刺组织切取 10-15 张。

c.    可做成白片或直接切至 1.5mL 离心管中备用。

1.2      核酸提取

按照试剂盒推荐配套提取试剂盒说明书操作步骤进行 DNA  提 取。

2.    文库构建  2.1  DNA 打断

取试剂盒中阳性对照品（PC）和阴性对照品（NC）各 10μL 与 待测样本同步检测，待测样本按照如下步骤进行操作：

a.    DNA 进入量为 50ng-1.0μg，选择破碎片段大小为 300~370bp。

b.    推荐使用 Diagenode  Bioruptor  超声破碎仪或 Covaris  M220 Focused-Ultrasonicator 聚焦超声破碎仪进行超声打断。

c.        破碎体系：

d.    推荐打断条件如下：

2.2      磁珠纯化（核酸纯化试剂（南京世和医疗器械有限公司生产））

a.    核酸纯化试剂在使用前充分漩涡震荡混匀。

b.    加入样品体积 1.5 倍的核酸纯化试剂，用移液器上下混匀。

c.     室温下静置 5min 后，置于磁力分离架上5min，直至上清澄清。 小心移去上清。

d.    置于磁力分离架上，加入 200μL 新鲜配制的80%乙醇，室温静 置 30sec ，吸弃上清。

e.    重复步骤 d，并尽量去除所有残留乙醇溶液。

f.     离心管留于磁力分离架上室温开盖 5min  干燥，使乙醇全部挥 发。

g.    加入 28μL 无酶水，从磁力分离架取下，使用移液器上下混匀。 室温孵育 5min。

h.    置于磁力分离架上 5min，取 25μL 进入下一步实验。

2.3      末端修复加 A 碱基

a.    在 0.2mL PCR 管中，按下表配制文库混合液 1。

b.    使用移液器上下吹吸将液体混匀，快速离心收集液体。

c.    将文库混合液 1 置于 PCR 热循环仪中按照以下条件进行孵育。

2.4      加接头

a.    孵育完成后按下表向装有混合液 1  的反应管中加入试剂盒内相

应组分试剂，完成混合液 2 配制。

b.    使用移液器上下吹吸将液体混匀，快速离心收集液体。将反应 管置于 PCR 仪上，20℃孵育 15min。

2.5      磁珠纯化（核酸纯化试剂（南京世和医疗器械有限公司生产））

a.     核酸纯化磁珠在使用前室温平衡30min，并充分漩涡震荡混匀。

b.    连接反应完成后，立即加入连接反应体积 0.9×（49.5μL）的核 酸纯化试剂。使用移液器上下混匀。

c.     室温下静置 5min 后，置于磁力分离架上5min，直至上清澄清。 小心移去上清。

d.    置于磁力分离架上，加入 200μL 新鲜配制的80%乙醇，室温静 置 30sec ，吸弃上清。

e.    重复步骤 d，并尽量去除所有残留乙醇溶液。

f.     离心管留于磁力分离架上室温开盖 5min 干燥，保证所有乙醇全 部挥发。

g.    加入 20μL 无酶水，从磁力分离架取下，使用适宜量程的移液器 上下混匀。室温孵育 5min，带磁珠进入下一步实验。

2.6  PCR 扩增

a.    按下表加入试剂，配制混合液 3（配制过程于冰上完成）：

注：同批次上机检测时，不同样本分别加入不同编号的文库扩 增引物。

b.    使用移液器上下吹吸将液体混匀，短暂离心收集液体。

c.    将配制好的混合液 3 置于 PCR 仪，按以下反应程序扩增：

*根据样本质量及进入量选择适当循环数，以获得足够文库进行富集。 2.7  磁珠纯化（核酸纯化试剂（南京世和医疗器械有限公司生产））

a.    核酸纯化磁珠在使用前应充分室温平衡 30min，并充分漩涡震 荡混匀。

b.    加入 PCR 反应终体积等量（50μL）的核酸纯化试剂。使用适宜 量程的移液器上下混匀。

c.     室温下静置 5min 后，置于磁力分离架上5min，直至上清澄清。

小心移去上清。

d.    置于磁力分离架上，加入 200μL 新鲜配制的80%乙醇，室温静 置 30sec ，吸弃上清。

e.    重复步骤 d，并尽量去除所有残留乙醇溶液。

f.     离心管留于磁力分离架上室温开盖 5min 干燥，保证所有乙醇全 部挥发。

g.    加入 33μL 无酶水，使用移液器上下混匀。室温孵育 5min。

h.    置于磁力分离架上 5min，转移 30μL 上清至 1.5mL 离心管中，

进入下一步富集实验，取 1μL 使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 进行 DNA 定量。

3.    杂交捕获 3.1  文库杂交

a.    文库池常包含多个不同样本文库，根据文库 DNA  浓度计算文 库池进入量，混合获得文库池。文库池 DNA 总量为 0.5-2.0μg ， 建议同质量样本建立文库池。

b.    文库池 DNA 混合方案：文库扩增比例（Xi）＝扩增并纯化后文 库 DNA 总量/扩增前 DNA 样本总量。

临床样本文库平均扩增比例（X(-)）＝（X1＋X2 + ⅆ +Xn）/n，即

该文库池中，各样本文库扩增比例的平均数。

根据上表计算每个样本的文库进入量系数，依照该系数和文库 池总量计算每个样本的文库富集进入量，从而混合各样本得到文库 池。

推荐 NC 、PC 的进入量为X(-)／Xi。

c.    文库池按下表加入试剂，于 1.5mL 离心管中配制混合液 4。

d.    使用移液器上下吹吸将液体混匀，短暂离心收集液体。

e.    使用可控温真空干燥仪，建议设置干燥温度 45℃,打开管盖， 直至混合液 4 干燥完全。

f.     另取 0.2mL PCR 管，按下表加入试剂盒内相应组分，配制混合 液 5：

g.    将 12.5μL 混合液 5 加入到干燥后混合液 4 的反应管中，室温静 置 10min。使用移液器上下吹吸混匀，完全溶解 DNA 后，转移 至新的 0.2mLPCR 管中。

h.    加入 2.5μL 探针组分（P2），用移液枪上下快速吹吸混匀，配制 成文库杂交混合液（总体积 15μL）。

i.     将 PCR 管置于 PCR 仪并运行程序：95°C 加热 10min。每个循 环 3min 降 3°C（1℃/min），共 10 个循环，降至 65°C 保温，杂 交过夜，10-18 小时。

3.2  文库捕获和清洗

a.    按下表稀释富集试剂（单个富集反应试剂用量）：

b.    在恒温金属浴上 65℃预热 100μL 1×清洗缓冲液 1（W1）及 400μL 1×清洗缓冲液 4（W4）。

c.     取出试剂盒中的磁珠组分（MB）漩涡震荡 3-5sec，重悬沉淀的 磁珠，恢复分散状态，每个富集反应取 50μL 至 1.5mL 低吸附 离心管中，室温静置 30min。

d.    将磁珠放于磁力分离架上约 1min ，吸弃上清。

e.    每 50μL 磁珠用 200μL 1×磁珠清洗液（BW）重悬，移液枪上下 吹吸混匀。将磁珠放于配套的磁力分离架上静置约 1min，吸弃 上清。

f.     重复步骤 e，取 100μL 1×磁珠清洗液（BW）重悬，用移液枪上 下吹吸混匀，并将混匀液转移至新 PCR 管中。

g.    PCR  管放于磁力分离架上约 1min，吸弃上清，立即加入 15μL 杂交后的文库混合液。将 PCR 管从磁力分离架上取下，移液枪 上下吹吸混匀，使磁珠在文库杂交混合液中充分重悬。

h.    将 PCR 管置于 PCR 仪中，设置 65°C 孵育 45min。每隔 15min 使用移液枪上下吹吸混匀，以尽量保证磁珠在孵育过程中处于 悬浮状态。

i.     孵育结束后，加入 100μL 65℃预热的 1×清洗缓冲液 1（W1）， 使用移液枪上下吹吸混匀 10 次，并转移到 1.5mL 低吸附离心 管中。将离心管放于磁力分离架上约 1min ，吸弃上清。

j.     离心管中加入 200μL 65℃预热的 1×清洗缓冲液 4（W4），移液 枪上下吹吸混匀 10 次后置于恒温金属浴 65°C 孵育 5min（转速 400rpm）。孵育后离心管放于磁力分离架上约 1min，吸弃上清。

k.    重复步骤j 一次。

l.     依次加入室温 1×清洗缓冲液 W1-W3  进行富集清洗：先加入 200μL 室温清洗缓冲液 1（W1），涡旋点震 2min。离心管放于 磁力分离架上约 1min，吸弃上清。

m.   加入 200μL 室温 1×清洗缓冲液 2（W2），涡旋点震 1min。离心 管放于磁力分离架上约 1min ，吸弃上清。

n.    加入 200μL 1×清洗缓冲液 3（W3），涡旋点震 30sec。离心管放 于磁力分离架上约 1min ，尽量吸弃全部残留液体。

o.    将离心管继续置于磁力分离架上，室温开盖干燥 3min，以去除 残留水分，尽量干燥磁珠。

p.    将离心管从磁力分离架上取下，加入 40μL 无酶水重悬磁珠，移 液枪上下吹吸混匀。按 20μL/管将磁珠悬液等量分装至 2 个 PCR 管中，分别标记两管，并分别进行后续实验。

3.3  PCR 扩增

a.    每管分别按下表加入试剂，配制得到 2 管混合液 6。

b.    将 2 管混合液 6 分别置于 PCR 仪上，按以下反应程序扩增，

*循环数根据富集起始样本量调整。

4.    上机前处理

4.1  磁珠纯化（核酸纯化试剂（南京世和医疗器械有限公司生产））

a.    合并 2 管混合液 6 扩增产物，核酸纯化试剂在使用前充分漩涡 震荡混匀。

b.    加入 PCR 反应终体积 1.5×（150μL）的核酸纯化试剂重悬。使 用移液器上下混匀。

c.     室温下静置 5min 后，置于 1.5mL 磁力分离架上 5min，直至上 清澄清。小心吸弃上清。

d.    置于磁力分离架上，加入 500μL 新鲜配制的80%乙醇，室温静 置 30sec ，吸弃上清。

e.    重复步骤 d，并尽量去除所有残留乙醇溶液。

f.     离心管留于磁力分离架上室温开盖 5min 干燥，保证乙醇全部挥 发。

g.    加入 23μL 无酶水，使用适宜量程的移液器上下混匀。室温孵育 5min。

h.    置于 1.5mL 磁力分离架上 5min，取20μL 作为待上样富集文库， 取 1μL 使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 进行 DNA 定量，以计 算富集文库浓度及总量。

4.2  文库质检

文库 qPCR 定量

以 KAPA Library Quantification Kit 试剂盒为例，对待上机富集文库 进行定量，以调整至合适上机浓度。

4.2.2.1  试剂准备

a.  准备适量的 DNA 稀释缓冲液：使用无酶水将 1×IDTE 缓冲液稀 释至 0.1×, 每个文库约需 1.1mL 稀释缓冲液。使用前，将缓冲液放 至室温。

b.  冰上解冻试剂盒中各组分，使用前充分混匀，短暂离心，置于冰 上备用。

4.2.2.2  样本准备

a.  使用 DNA 稀释缓冲液对富集文库进行稀释。取 1μL 富集文库进 行 1:1,000 、1:50,000 稀释。

4.2.2.3  点样及程序设置

a.  向PCR 反应板需要进行反应的孔中各加入混有引物的6μL Master Mix 以及 2ul 无酶水。

b.  向每个样本孔中加入对应的2μL 已稀释的 DNA 文库（1:50000）。 c.  向标准品孔中各加入 2μL DNA 标准品，按照从低浓度到高浓度 顺序加入。

d.  向阴性对照孔中加入 2μL 稀释缓冲液。

e.  密封 PCR 反应板，放入微孔板离心机中离心 1min。

f.  将反应板装载到 qPCR 仪上并按照下表参数运行 qPCR 仪：

注：配制总体积＞10μL 时，反应体系中各用量按比例增加，如配制 总体积 20μL 时，反应体系中各用量×2。

4.2.2.4  数据分析

a.  按照 KAPA Library Quantification Kit 试剂盒说明书进行待检文库 的浓度计算。

b.  若最终文库总摩尔质量<0.008pmoles，需要重新进行文库杂交富 集或重新进行建库，若再次不合格，终止检测。

5.    测序

5.1  文库预处理

5.1.1 准备变性试剂：取 200μL 1N NaOH 浓储，加 800μL 无酶水配 制成 0.2N NaOH，涡旋混匀，短暂离心，室温放置备用。

5.1.2.文库变性：取2μL 文库（不低于 4nM）至低吸附管管底，再加 入 2μL 0.2N NaOH，吹打混匀，关闭管盖室温孵育 5min。变性后的

4μL 文库中加入 2uL 200mM 的 Tris-HCl pH8.0，吹打混匀。之后立 即置于冰上。

5.1.3.  文库稀释：向变性好的 6μL 文库加入 394μL 预冷文库稀释缓 冲液 HT1，混匀后快速离心。再从 400μL 稀释液中取 117μL 文库与 1183μL 预冷的 HT1 混合。吹打混匀，之后立即置于冰上备用。

5.2  上样

5.2.1.使用洁净的 1mL 枪头刺穿 Load Samples（装入样品）孔的封 箔，将 1.3mL 已制备文库注入 Load Samples（装入样品）孔中。避 免接触封箔。

5.2.2.加载样品后检查孔中是否有气泡，如果有气泡在工作台轻轻敲 打试剂盒以释放气泡。

5.2.3. 将加载好样 品 的测序试剂盒使用 NextSeq550Dx   测序仪 （Illumina 公司）进行测序。

5.2.4.PCA 文库扩增引物标签序列对应表

6.    生物信息分析与结果解读

本产品结果分析采用《实体瘤多基因突变分析软件》（以下简称 分析软件）对原始数据进行分析。分析软件可实现从测序仪原始数 据下机到报告的自动化分析。相关数据分析流程如下：

6.1  数据转换拆分：该模块对下机测序数据（BCL 格式）进行转换， 根据 SampleSheet（样本名及 index）将 BCL 文件转换成 FASTQ 格式。

6.2   Fastq 质控：该模块对 FASTQ 数据进行质量控制，去除建库过程 中引入的接头序列以及低质量碱基片段。

6.3   比对参考基因组：使用分析软件的序列比对模块将 FASTQ 文件 中的碱基序列比对至 hg19 (GRCh37)  人类参考基因组。

6.4   BAM 文件排序：对 bam 文件进行排序。

6.5   BAM 文件去重复：对 bam 文件进行 PCR 序列去重复。

6.6  融合分析：使用分析平台的融合分析模块分析样本的融合。

6.7  数据质控标准：要求样本 Q30 数据不低于 75%，平均测序深度 不低于 700×。

6.8  经过以上步骤分析流程处理后，符合质量指标要求的突变结果 进行阴/阳性判断。

【阳性判断值】

融合：嵌合 reads 数≥4，则该位点为突变阳性，反之，则判断为阴 性。

【检验结果的解释】

1.     阴性对照品（NC）的检测结果应为阴性，若有相关突变检出， 说明环境中可能存在 DNA 污染源。

2.     阳性对照品（PC）的检测结果应为 NTRK1/NTRK2/NTRK3 均为阳 性，如果未检出，说明试剂盒性能不理想或操作过程有误，此次检 测结果无效。

【检验方法局限性】

1.     本试剂盒仅用于患者 FFPE 样本的体外定性诊断，其检测结果仅 供临床参考，不应作为临床诊疗的唯一依据。

2.     本试剂盒只对说明书中涵盖的基因及变异类型有效。因此当本 试剂盒检测结果为阴性时，并不能排除被检测样本携带本试剂盒检 测范围外的其他基因及位点突变。

3.     阴性结果不能完全排除靶基因突变的存在，样本中肿瘤细胞较 少、基因变异类型不在试剂盒检测范围内、突变比例低于试剂盒最 低检测限、样本降解、样本污染、样本中存在过量干扰物质、不正 确的样本保存、不正确的试剂盒保存、试剂盒过期等亦可能产生阴 性检测结果。

4.     由于肿瘤组织可能存在较大异质性，不同部位取样可能会得到 不同的检测结果。

5.     不合理的样本采集、转运及处理、以及不当的试验操作和实验 环境均有可能导致假阴性或假阳性结果。

6.     本试剂盒用于检测保存年限不超过 6 年的 FFPE 组织样本，超过 6 年的 FFPE 样本的检测结果可能受到影响。

7.     本试剂盒检测结果与临床诊断结论不一致时，建议对检验结果 进行复检，并最终以临床诊断结论为准。

8.     在肿瘤的不同发展阶段，肿瘤细胞的基因突变情形可能发生改 变，因此不同取样时间的检测结果可能存在差异。

【产品性能指标】

1.     阳性参考品符合率：检测企业参考品中的阳性参考品，试剂盒 检测范围内所标注的位点均应检出。

2.     阴性参考品符合率：检测企业参考品中的阴性参考品，试剂盒 检测范围内所标注的位点均不应检出。

3.     精密度：检测企业参考品中的重复性参考品，重复检测 5 次， 阴性重复性参考品结果试剂盒检测范围内所标注的位点均不检出， 阳性重复性参考品结果试剂盒检测范围内所标注的位点均检出。对

阴性、弱阳性和中强阳性临床样本进行批内、批间、日间、不同仪 器、操作人员间、实验室间等多维度进行研究。阴性临床样本结果 试剂盒检测范围内所标注的位点均不检出；弱阳性和中强阳性临床 样本结果试剂盒检测范围内所标注的位点均应检出。

4.   检测限：50ng 基因组 DNA，且其 NTRK1/NTRK2/NTRK3 基因的融 合变异频率低至 2%。

5.     临床样本中可能存在的潜在干扰物如福尔马林（0.005%V/V）、 蛋白酶 K（0.08mg/mL），石蜡（1%V/V）、酒精（1%V/V）、甘油三酯 （3mg/mL）、血红蛋白（2g/L）、坏死组织（50%V/V）均不干扰本试 剂盒的检测结果。试剂盒检测过程中可能存在于样本中的金黄色葡 萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、结核分枝杆菌 和铜绿假单胞菌均不影响本试剂盒结果的正常检出。检测同源基因 和试剂盒检测范围外的变异类型（NTRK1/NTRK2/NTRK3 同源基因）、 以及高浓度基因组，结果与本试剂盒均不发生交叉反应。

6.     临床试验结果

本试剂盒的临床试验在 7 家临床机构开展，同时通过桥接试验 的方式完成了伴随诊断的研究。

临床性能研究：采用本试剂盒与临床参考方法进行对比试验， 共计完成 2422 例有效样本。试验结果显示该产品与参考方法阳性符 合率 98.02%，阴性符合率 99.74%。

恩曲替尼伴随诊断研究：采用本试剂盒对药物临床试验剩余样 本进行桥接试验，67 例可评估结果显示该产品与 CTA 的阳性符合率 92.54%，阴性符合率 99.36%。经本试剂盒桥接检测为阳性患者的疗 效分析显示，客观缓解率（ORR）为 71.0%，与药物临床试验结果无 显著差异。

【注意事项】

1.     本试剂盒仅用于体外定性检测，使用前请仔细阅读本说明书。 2.     临床基因扩增实验室及实验室操作人员资质应当严格遵循《医 疗机构临床基因扩增管理办法》（卫办医政发（2010）194 号）。

3.     标本的容器、标本的处理以及检验过程中使用的材料的处理须 符合《医疗废物管理条例》和《医疗卫生机构医疗废物管理办法》 以及国家和地区的相关要求。

4.     所有化学药品都具有潜在危险性。只有经过培训且具有相应实 验室技术的专业人员才能使用本试剂盒进行检测。操作时，请穿着 合适的实验室工作服、并佩戴一次性手套等防护性措施。使用过的 试剂盒为医疗废弃物，应妥善处理。

【参考文献】

[1]. Vaishnavi A, Le AT, Doebele R C. TRKing down an old oncogene in a newera of targeted therapy[J]. Cancer discovery, 2015, 5(1): 25-34.

[2]. Khotskaya Y  B,  Holla V  R,  Farago  A  F, et al. Targeting TRK family proteins in cancer[J]. Pharmacology & therapeutics, 2017, 173: 58-66.

[3]. Westphalen C B, Krebs M G, Le Tourneau C, et al. Genomic context of   NTRK1/2/3   fusion-positive    tumours   from    a    large    real-world population[J]. NPJ precision oncology, 2021, 5(1): 69.

[4]. Ling Q, Li B, Wu X, et al. The landscape of NTRK fusions in Chinese patients with solid tumor[J]. Annals of Oncology, 2018, 29: viii22-viii23.

【基本信息】

注册人/生产企业/售后服务单位名称： 南京世和医疗器械有限公司

住所：南京市江北新区华康路 128 号 A 座 6 层 联系方式：

网址：        E-mail：

生产地址：南京市浦口区华康路128号一期A栋6层、B栋B245-B261 室

生产许可证编号

【医疗器械注册证编号/产品技术要求编号】 【说明书批准日期/生效日期及修改日期】

附表 1：临床前性能研究及临床试验已验证基因融合位点列表