十三种肺癌相关抗体检测试剂盒（流式荧光免疫法）（CSZ2400157）

受理号：CSZ2400157

体外诊断试剂产品注册技术审评报告

产品中文名称：十三种肺癌相关抗体检测试剂盒（流式荧 光免疫法）

产品管理类别：第三类

申请人名称 ：广州市丹蓝生物科技有限公司

国家药品监督管理局  医疗器械技术审评中心

目  录

基本信息 3

一、申请人名称 3

二、申请人住所  3

三、生产地址 3

技术审评概述  4

一、产品概述 4

二、临床前研究概述  6

三、临床评价概述  12

四、产品受益风险判定  13

综合评价意见  15

基本信息

一、申请人名称

广州市丹蓝生物科技有限公司

二、申请人住所

广州国际生物岛螺旋三路 8 号第一层 102 单元

三、生产地址

广州国际生物岛螺旋三路 8 号第一层 102 单元

技术审评概述

一、产品概述

（一）产品主要组成成分

主要组成成分如下：

（二）产品预期用途

本试剂盒用于体外检测人血清中 13 种肺癌相关抗体（识别  BRAF、CAGE、EFHD2、ESO1、GBU4-5、MAGE A4、pGP9.5 、 SOX2 、p53 、TM4SF1 、ZNF573 、BMI1 及 FXR1 的相应抗体） 的浓度。通过“十三种肺癌相关抗体检测分析软件”计算样本的  P 值，用于根据胸部 CT 的影像学结果，临床上无法判断是否需  要进行侵入性检查的肺结节患者，进行肺癌的辅助诊断。

检测结果阳性不作为肺癌早期诊断或确诊的证据，检测结 果阴性也不能排除肺癌的可能，患者最终诊断应依据影像学和/ 或穿刺活检、手术病理检查结果。该产品不用于普通人群的肿 瘤筛查，仅作为辅助诊断供临床医生参考。

（三）产品包装规格

12 人份/盒、28 人份/盒、44 人份/盒。

（四）产品检验原理

本试剂盒使用 Luminex 200  多功能流式点阵仪检测血清中 的 13  种肺癌相关抗体的相对浓度。本试剂盒使用的 13  个从 E.coli  表达纯化的肺癌相关抗原蛋白均带有链霉亲和素和 Myc 标签，用于蛋白的表达、纯化、磁珠偶联和检测。磁珠表面预先 偶联有生物素化的 BSA，通过生物素与链霉亲和素之间的高特 异性亲和反应将 13 个抗原蛋白分别间接偶联到 13 种不同编码

的磁珠表面。将 13 种磁珠以一定数量混合，加入稀释好的血清 样本孵育后，血清中对应的肺癌相关抗体与 13 种磁珠上分别包 被的抗原特异结合，再与藻红蛋白（R-Phycoerythrin ，RPE）标 记的 RPE-驴抗人 IgG 荧光抗体孵育反应，形成“磁珠-肺癌相关 抗原-相应抗体-荧光二抗”结合物。在 Luminex 200 多功能流式 点阵仪上进行检测，受检的磁珠由鞘流系统形成单列依次通过 两束激光照射，一束激光用于激发磁珠的荧光编码信号从而区 分被测相关抗体的类别，另一束激光用于激发 RPE 荧光抗体的 信号，磁珠上所带的 RPE 荧光信号的强弱与血清中的相关抗体 浓度正相关。经配制的不同浓度的校准品分别与各种磁珠对应 的荧光信号值拟合成剂量-反应标准曲线，通过该标准曲线方程 可计算出血清样本中各相关抗体的浓度。

本检测试剂盒中，磁珠偶联的一组抗原是通过基因工程方 法表达并纯化。每个抗原都带有同一个 Myc 肽段标签。本产品 采用重组人源化抗 Myc 标签的免疫球蛋白（Anti-Myc）作为校 准品，可特异性的识别所有带 Myc 标签的抗原。

二、临床前研究概述

（一）主要原材料

1.主要原材料的选择

本产品主要原材料包括 Anti-Myc 、13 种肺癌相关抗原、磁

珠、RPE 标记的驴抗人 IgG 二抗、Biotin-BSA、驴血清等。主要 原材料均为外购。

申请人对主要原材料进行了供应商的选择，通过功能性实 验筛选出最佳的主要原材料和供应商，制定了各主要原材料的 质量标准并经检验合格。

2.企业参考品和质控品的设置情况

本产品企业参考品包括阴性参考品、阳性参考品、准确度回 收参考品、精密度参考品、检出限参考品、线性参考品。企业参 考品均来源于临床血清样本，具体如下：

阴性参考品 10 份，包括肺部良性疾病血清样本、自身免疫 疾病血清样本、其他肿瘤患者血清样本。阳性参考品 6 份，包 括不同组织类型肺癌血清样本。准确度回收参考品 26 份，其中 每个靶标均包含高、低浓度的血清样本各 1 份。精密度参考品 2 份，包括各靶标高、低浓度血清样本。检出限参考品 13 份， 由各个靶标的低浓度血清样本组成。线性参考品 91 份，包括所 有靶标不同浓度水平血清样本。

该产品设置了 2 个不同浓度水平质控品，用于检测过程的 质量控制。

（二）生产工艺及反应体系研究

申请人根据试剂盒中试剂及组分的主要生产工艺的研究结

果，确定了最佳的生产工艺。

对产品反应体系的研究包括样本类型的选择、样本加样量 确定、血清稀释倍数的确定、反应体积的确定、工作液浓度的确 定、孵育条件和反应时间的确定、检测条件参数设置等一系列 研究，最终确定了最佳反应体系。

（三）分析性能评估

分析性能评估内容包括校准品的溯源性研究、准确度、精密 度、分析特异性、检出能力、线性、高剂量钩状效应等的评估， 申请人提交了有效运行的质量管理体系下生产的多批产品，在 适用机型上进行的分析性能评估资料。

溯源性研究中，申请人建立了企业量值参考物，产品校准品 溯源至企业校准品，企业校准品溯源至企业量值参考物。

准确性研究中， 申请人使用 3 批试剂盒对高、中、低浓度 的 3 份样本进行回收实验，实验结果显示，3 批试剂盒检测各样 本的靶标的回收率均介于 80%-120%之间。申请人采用肺癌、良 性肺病、健康人群样本，与已上市试剂进行方法学比对，结果显 示针对共有靶标本产品检测结果和对比方法检测结果相关性良 好。同时申请人采用肺癌、良性肺病、不同自身免疫疾病、其他 恶性肿瘤及正常人群血清样本，与临床诊断结果进行比对研究， 实验结果显示，试剂盒的检测性能满足要求。

精密度研究中，申请人使用 3 批试剂盒检测高、中、低浓 度水平临床混合样本，对试剂盒的批内/批间、日内/日间，试验 轮次内/轮次间、操作者间、仪器间、实验室间的精密度进行评 价。研究结果显示高值样本、中值样本以及低值样本的各靶标 检测结果重复性、中间精密度和再现性 CV 均小于 15.0%，样本 的阴阳性结果 100%一致。

分析特异性研究包括交叉反应和干扰试验研究。

在交叉反应研究中，使用 3 批试剂对含有高浓度肿瘤标志 物 的 临床 样本进行 交 叉反 应研 究， 结果表 明 当在血 清 中 CYFRA21-1（20 ng/mL）、CEA（500 ng/mL）、CA125（50 U/mL）、 CA50（ 80 U/mL ）、NSE（ 100 ng/mL) 、SCC(10 ng/mL) 、Pro GRP(500 pg/mL)时， 与本产品均不产生交叉反应。 申请人采用 其他恶性肿瘤和肺部良性肿瘤样本进行交叉反应研究，结果显 示该产品特异性良好。申请人对其他常见肿瘤标志物同时升高 的临床样本进行了研究，结果表明临床样本中存在的其他常见 肿瘤抗原标志物时，该产品检测性能不受影响；对自身免性疾 病患者的血清样本进行研究，结果表明自身免疫疾病不影响该 产品检测性能。

在干扰试验研究中，使用 3 批试剂对含有可能产生干扰的 内源性及外源性物质的 13 种肺癌相关抗体高、中、低浓度的临

床样本进行检测，结果显示：内源性干扰物血红蛋白（ 10 mg/mL）、 胆红素（ 1.5 mM）、抗坏血酸（50 µg/mL  ）、甘油三酯（ 10 mM）、

胆固醇（5mg/mL）、生物素（2000 ng/mL）、抗核抗体（滴度 1：

1000）、人抗鼠抗体 596ng/mL、人类风湿因子（ 1000U/mL）及 外源性干扰物质阿奇霉素（ 100μg/mL），利巴韦林（ 100μg/mL），

异烟肼（ 75μg/mL ）， 盐 酸 阿 比 多 尔（ 100μg/mL ）， 利福平   （ 300μg/mL），磷酸奥司他韦（ 100 μg/mL），盐酸左氧氟沙星   （2.25μg/mL），头孢曲松（300μg/mL）， 丙酸倍氯米松（ 50μg/mL） 丙酸氟替卡松（200 µg/mL），布地奈德福莫特罗（320 µg/mL），

上述干扰物质在所示浓度对本试剂盒的检测结果无影响。

检出限研究中，申请人使用 3 批试剂盒对 4 份低浓度临床 样本进行检测，确定试剂检出限。经验证最终确定检出限为不 高于 1.23U/mL（还原浓度为 30.76U/mL）。

线性区间研究中，申请人采用 9 个浓度水平梯度稀释样本， 使用 3 批试剂盒分别对其进行检测，初步确定线性区间。线性 区间验证使用 3 批试剂盒对每一靶标对应的 7 个浓度水平的梯 度稀释临床样本进行检测。最终确定各靶标的线性范围为 1.23 到 600U/mL，相关系数均大于 0.9900。

高剂量钩状效应研究中， 申请人采用 3 批试剂盒进行高剂 量钩状效应研究，对每一靶标对应的两例高浓度临床样本进行

梯度稀释后由低浓度至高浓度开始检测，每个梯度的稀释液重 复 3 次。检测结果显示，各靶标在测试浓度下，均未出现高剂 量钩状效应。

（四）阳性判断值研究

阳性判断值的建立研究选取了 452 例不同分期、不同组织 类型肺癌血清样本和 351 例良性肺病血清样本。采用二元逻辑 回归方法对 13 个靶标的结果进行联合建模，确定 13 种靶标的 逻辑回归方程。再通过受试者特征（ROC）曲线分析确定了试  剂盒的阳性判断值。

然后采用 262 例血清样本对阳性判断值进行验证，验证结 果显示建立的阳性判断值符合适用人群的判定。

最终确定本产品的阳性判断值为 0.70727。当 P＜ 0.70727 时判定为阴性，当 P ≥ 0.70727 时判定为阳性。

（五）稳定性研究

申请人进行的稳定性研究，包括实时稳定性、使用稳定性、 运输稳定性等。

实时稳定性研究采用3 批试剂盒置于规定储存条件下放置， 分别于 0 点、第 3 月、第 6 月、第 9 月、第 12 月、第 13 月、 第 14 月时，对试剂盒的外观与装量、线性、准确度、最低检测 限、重复性进行考察，各项性能指标均符合要求。确定试剂盒按

照规定的储存条件保存，有效期为 12 个月。

此外，样本稳定性和试剂运输及使用稳定性研究结果支持 说明书声称。

三、临床评价概述

申请人在华中科技大学同济医学院附属同济医院、中山大 学孙逸仙纪念医院和首都医科大学附属北京胸科医院共三家临 床机构进行临床试验。采用试验体外诊断试剂与临床参考标准 进行比较研究，确认本产品的临床性能。入组病例均为胸部 CT  检查为肺结节的患者，样本类型为血清，共纳入临床有效病例 1463 例。其中肺癌病例 794 例，包括 0 期 63 例、I 期 399 例、 Ⅱ期 82 例、Ⅲ期 130 例、Ⅳ期 86 例等；包括不同组织分型的病 例，其中鳞癌 122 例、腺癌607 例、小细胞癌31 例等。非肺癌 的其他病例共 669 例，包括肺部良性疾病（肺良性结节、肺结 核、肺炎性假瘤等）406 例、其他系统恶性肿瘤（肠癌、肝癌、 胃癌、食管癌、乳腺癌等）192 例、自身免疫性疾病 42 例以及 其他干扰病例 29 例。

试验结果显示，本产品针对肺癌病例临床灵敏度为 67.25% （ 95%CI：63.87%，70.51%），针对非肺癌病例临床特异度为 85.50%（95%CI：82.60% ，88.08%）。上述结果显示试验体外诊 断试剂具有较好的临床灵敏度和特异度。

综上所述，临床试验结果显示本产品的临床性能满足技术 审评要求。

四、产品受益风险判定

本公司参照 YY/T 0316-2016《医疗器械 风险管理对医疗 器械的应用》对医疗器械产品的安全风险进行了分析。

（ 一）受益评估

本试剂盒用于体外检测人血清中 13 种肺癌相关抗体（识别  BRAF、CAGE、EFHD2、ESO1、GBU4-5、MAGE A4、pGP9.5 、 SOX2 、p53 、TM4SF1 、ZNF573 、BMI1 及 FXR1 的相应抗体） 的浓度。通过“十三种肺癌相关抗体检测分析软件”计算样本的  P 值，用于根据胸部 CT 的影像学结果，临床上无法判断是否需  要进行侵入性检查的肺结节患者，进行肺癌的辅助诊断。

检测结果阳性不作为肺癌早期诊断或确诊的证据，检测结 果阴性也不能排除肺癌的可能，患者最终诊断应依据影像学和/ 或穿刺活检、手术病理检查结果。该产品不用于普通人群的肿 瘤筛查，仅作为辅助诊断供临床医生参考。

（二）风险评估

根据申请人提供的申报材料，经综合评价, 在目前认知水 平上，认为该产品上市带来的受益大于风险。但为保证使用安

全，基于对主要剩余风险的规避, 需要在说明书中提示以下信 息:

1.预期用途：检查结果阳性不作为肺癌早期诊断或确诊的 证据，检测结果阴性也不能排除肺癌的可能，患者最终诊断应 依据影像学和/或穿刺活检、手术病理检查结果。该产品不用于 普通人群的肿瘤筛查，仅作为辅助诊断供临床医生参考。

2.警示及注意事项：产品说明中介绍了该产品检验方法的 局限性及使用中的注意事项。

综合评价意见

本申报项目为境内第三类体外诊断试剂产品注册，依据《医 疗器械监督管理条例》（国务院令第 739 号）、《体外诊断试剂注 册与备案管理办法》（国家市场监督管理总局令第 48 号）等相 关医疗器械法规与配套规章，经对申请人提交的注册申报资料 进行系统评价, 申报产品符合安全性、有效性的要求，符合现有 认知水平，建议准予注册。

2025 年 11 月 10  日

附件：产品说明书

附件

十三种肺癌相关抗体检测试剂盒（流式荧光免疫法）说明书

【产品名称】

通用名称：十三种肺癌相关抗体检测试剂盒（流式荧光免疫法）

【包装规格】

12 人份/盒、28 人份/盒、44 人份/盒。

【预期用途】

本试剂盒用于体外检测人血清中 13 种肺癌相关抗体（识别 BRAF 、CAGE 、EFHD2、 ESO1 、GBU4-5 、MAGE A4 、pGP9.5 、SOX2 、p53 、TM4SF1 、ZNF573 、BMI1 及 FXR1   的相应抗体）的浓度。通过“十三种肺癌相关抗体检测分析软件”计算样本的 P 值，用于 根据胸部 CT 的影像学结果，临床上无法判断是否需要进行侵入性检查的肺结节患者，进 行肺癌的辅助诊断。

检测结果阳性不作为肺癌早期诊断或确诊的证据，检测结果阴性也不能排除肺癌的可 能，患者最终诊断应依据影像学和/或穿刺活检、手术病理检查结果。该产品不用于普通人 群的肿瘤筛查，仅作为辅助诊断供临床医生参考。

肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症之一，近年来肺癌发病率逐步升高，最新的卫 生统计年鉴显示，肺癌死亡率占我国恶性肿瘤死亡率的第一位。肿瘤初期， 机体的免疫系统 可识别肿瘤细胞表达异常的蛋白，即肿瘤相关抗原，分泌针对这些抗原的自身抗体。 肿瘤 相关抗原是肿瘤发生、发展过程中细胞呈递抗原信息或者坏死释放、脱落、外分泌的异常表 达的蛋白，其与人体免疫系统相互作用可产生特异性自身抗体。自身抗体具有免疫监视和 免疫放大的作用，不仅可以灵敏地反映肿瘤相关抗原的存在，同时由于免疫细胞可以在一 定时间段内持续分泌自身抗体，使其在循环系统中具有更高和更稳定的丰度，所以可作为 肿瘤甚至早期肿瘤的标志物。目前常用的自身抗体检测技术包括酶联免疫吸附实验、噬菌 体展示技术、血清蛋白组学分析及蛋白芯片等常见方法，多种方法的应用丰富了自身抗体 表达水平的检测手段。

（1）BRAF：基因作为 RAF 基因家族中的一员，是一种常见的原癌基因。它位于人类 染色体 7q34，长约 190kb，由其翻译的 BRAF 蛋白由 783 个氨基酸组成，拥有三个保守蛋 白结构域。BRAF 基因是属于 RAS 的下游信号分子,它编码的激酶是 RAS/RAF/MEK/MARK  信号通路的关键成分，该信号通路承担着调节细胞的生长、增殖和凋亡总体过程的重要作 用，BRAF 作为原癌基因的一种，当发生基因突变时，BRAF 突变蛋白会出现持续的活化， 激活状态，从而使细胞出现无限制的分裂和增殖，造成肿瘤的发生与形成[1,2]。

（2）CAGE：属于 Dead box 解旋酶家族，该蛋白不表达在正常的组织，只表达于恶性 肿瘤和睾丸组织，因此被称为肿瘤/睾丸抗原。它的表达量与细胞周期有关，它在癌细胞中 激活 ERK 和 p38 蛋白并增加肿瘤细胞的扩散，CAGE 在肺癌血清中高表达，在肺癌早期诊 断中具有重要意义[3]。

（3）EFHD2：也称 Swiprosin-1，是一种保守的 EF 手性卷曲螺旋蛋白，在免疫细胞活

化、细胞迁移、凋亡、肿瘤侵袭和细胞转移、神经元传输等方面起重要作用，EFhd2  参与 JAK-STAT、MAPK、NF-κB 和 Ca2+等信号通路的调节。EFHD2 参与非小细胞肺癌中 Caspase- 9 蛋白复合物的形成过程，促进 Caspase-9  活化，与细胞凋亡相关[4-6]。

（4）ESO1：又称 NY-ESO-1，属于肿瘤/睾丸抗原（cancer testis antigen ，CTA）家族的  一种肿瘤特异性抗原，能激发肿瘤患者同时产生细胞免疫和体液免疫，被认为是目前免疫  原性最强的肿瘤/睾丸抗原之一。并且机体针对 NY-ESO-1  的体液免疫应答持续较长的时间。 在肺癌，卵巢癌、前列腺癌等在多种类型肿瘤中广泛表达。NY-ESO-1表达与肿瘤组织分级、

肿瘤的发生发展及预后有关。在肿瘤早期诊断、肿瘤发生发展的监测、治疗效果的评价等方 面具有重要的价值[7-9]  。

（5）GBU4-5：该蛋白属于 Tudor domain 蛋白家族，是一种 ATP 结合 RNA 解旋酶， 在细胞进程中发挥重要作用，包括 RNA 代谢、生殖细胞发育、转座子沉默、DNA 损伤反 应、组蛋白修饰和染色质重构等。 GBU4-5 在癌变过程中发挥重要作用，在非小细胞肺癌中 表达明显增高，具有肿瘤特异性和强免疫原性[10-12]。

（6）MAGE A4：该蛋白属于 MAGE 家族，是一种肿瘤特异性睾丸癌抗原，MAGE A4 在肺癌等恶性肿瘤中呈高表达，而在正常组织低表达或不表达，MAGE A4 参与了细胞凋亡 和细胞周期进程。它的高表达也影响化疗药物对恶性肿瘤凋亡的敏感性[13-16]。

（7）pGP9.5：是一种泛素水解酶，是“神经和神经外胚层”肿瘤特异性标志物，在多种 非神经内分泌癌中都有表达。在肿瘤中 pGP9.5 对环蛋白的去泛素化增加，有助于体细胞的 非卷积生长，这是癌症的标志。pGP9.5 在原发性肺癌和肺癌细胞系中均高表达，但在正常 细胞中检测不到。pGP9.5  的表达与肺癌的病理分期密切相关，44%的 Ⅰ期非小细胞肺癌和 75%的Ⅱ期与Ⅲa  期非小细胞肺癌中均有大量 pGP9.5 表达[17-19]。

（8）SOX2 是一种干细胞转录因子，SOX2 过表达可以促进肺癌细胞的增殖，侵袭和 转移。SOX2 是与肺癌相关的癌基因，在肺鳞癌的发生发展中具有极其重要的作用，与鳞癌 鳞状上皮分化有关，可诱导鳞癌标记物 p63 和 keratin 6 的表达，激活下游表皮生长因子受 体和胰岛素样生长因子-1，从而促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移。SOX2 在 NSCLC 中的高 表达可以促进 NSCLC 患者淋巴结转移和较晚的临床分期，在 NSCLC 的浸润及转移过程中 起重要作用，SOX2 高表达的肿瘤恶性程度更高，是预后不佳的独立预测因子[20-22]。

（9）p53：该基因又称为 p53，tp53，是一种抑癌基因。p53 蛋白是一种肿瘤抑制蛋白， 该蛋白主要调控与细胞周期停滞、凋亡、衰老、DNA 修复和代谢相关的基因表达。在许多 癌症中，p53 基因突变导致的 p53 蛋白失活是癌症产生的一个重要步骤，p53  自身抗体通常 针对发生突变的基因产物而产生的。研究表明血清 p53  自身抗体在各病理分期的肺癌阳性 表达率均很高 [23-27]。

（10）TM4SF1：又称 TAL6 ，L6，属于 TM4SF 家族。TM4SF 家族的分子结构特点： 有四个高度保守的疏水跨膜区形成一个小的、大的胞外环， 一个短的胞内环，一个短的氨基 端和羧基端。TM4SF1 与人角蛋白细胞的迁移有关，主要是影响细胞侵袭能力，与细胞的侵 袭能力及不良预后呈正相关，TM4SF1 在人肺癌、结肠癌、乳腺癌等细胞表面表达。肺癌患 者标本中高表达 TM4SF1 基因与术后早期复发及短的生存期明显相关[28-31]。

（11）ZNF573(zinc finger protein 573) ：属于锌指蛋白，由645个氨基酸组成，是抑制肿 瘤凋亡相关因子6（TRAF6)的锌指蛋白，可抑制TRAF6对核转录因子-kappa B(NF-kappa B) 和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun Nterminalkinase)的诱导活化。通过调节TRAF6的信号活性而在 破骨细胞分化过程中起重要作用[32]。

（12）BMI1：是多梳蛋白(PCG)家族主要成员之一，与肿瘤的发生密切相关，参与调控 肿瘤细胞的增殖、分化与侵袭。 BMI1 作为原癌基因，位于细胞分化调节的源头，在干细胞 及肺脏和脑等多种恶性肿瘤中均呈高表达，对肿瘤细胞的增殖、衰老、细胞周期和细胞凋 亡、染色体稳定性的调节和自我更新能力起着关键作用。在包括非小细胞肺癌在内的多种 上皮细胞源恶性肿瘤中 BMI1 呈过表达，并且其表达水平与肿瘤的恶性程度、侵袭转移及预 后紧密相关[33-34]。

（13）FXR1：是脆性 X 智力迟钝相关基因家族中的一员，它们都有 RNA 绑定、与多 聚核糖体相关、在核与胞浆间穿梭的生理功能。FXR1  有两个不均一核糖核蛋白 K  区域

（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K homology,KH)和一个 RGG 盒，在体外可与人工 RNA 同聚物结合，FXR1 具有细胞生长依赖的翻译活性功能，FXR1 基因在鳞状细胞癌中有 很高的过表达比率，FXR1 对翻译活性的调节功能与细胞癌变有关[35-37]。

以上 13 个肺癌相关抗原，在肺癌发生、发展过程中可异常表达，其被免疫系统识别后 刺激机体产生免疫应答并释放相应的抗体。本产品仅用于临床对疑似肺癌患者的辅助诊断， 不作为确诊或排除肿瘤的唯一依据。

本试剂盒检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状、体征、病史、其他 实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

【检验原理】

本试剂盒使用 Luminex 200 多功能流式点阵仪检测血清中的 13 种肺癌相关抗体的相对 浓度。本试剂盒使用的 13  个从 E.coli  表达纯化的肺癌相关抗原蛋白均带有链霉亲和素和 Myc 标签，用于蛋白的表达、纯化、磁珠偶联和检测。磁珠表面预先偶联有生物素化的 BSA ， 通过生物素与链霉亲和素之间的高特异性亲和反应将 13 个抗原蛋白分别间接偶联到 13 种 不同编码的磁珠表面。将 13 种磁珠以一定数量混合，加入稀释好的血清样本孵育后，血清 中对应的肺癌相关抗体与 13  种磁珠上分别包被的抗原特异结合， 再与藻红蛋白（R- Phycoerythrin，RPE）标记的 RPE-驴抗人 IgG 荧光抗体孵育反应，形成“磁珠-肺癌相关抗原 -相应抗体-荧光二抗”结合物。在 Luminex 200 多功能流式点阵仪上进行检测，受检的磁珠 由鞘流系统形成单列依次通过两束激光照射， 一束激光用于激发磁珠的荧光编码信号从而 区分被测相关抗体的类别，另一束激光用于激发 RPE 荧光抗体的信号，磁珠上所带的 RPE 荧光信号的强弱与血清中的相关抗体浓度正相关。经配制的不同浓度的校准品分别与各种 磁珠对应的荧光信号值拟合成剂量-反应标准曲线，通过该标准曲线方程可计算出血清样本 中各相关抗体的浓度。

本检测试剂盒中，磁珠偶联的一组抗原是通过基因工程方法表达并纯化。每个抗原都  带有同一个 Myc 肽段标签。本产品采用重组人源化抗 Myc 标签的免疫球蛋白（Anti-Myc） 作为校准品，可特异性的识别所有带 Myc 标签的抗原。

【主要组成成分】

注意：不同批号试剂盒中各组分不能互换使用。

规格：12 人份/盒、28 人份/盒、44 人份/盒的主要组成成分：

注：1）不同批次的校准品浓度和质控品标示范围有所差异，具体见随盒附表：校准品、质控品标示范 围表。

2）本产品采用重组人源化抗 Myc 标签的免疫球蛋白（Anti-Myc）作为校准品。

3）本试剂盒校准品溯源至企业校准品。

需要但未提供的试剂

1. 纯化水

2. 鞘液：xMAP® Sheath Fluid PLUS（国械备 20200675 号）或 xMAP® Sheath Concentrate PLUS（国械备 20200676 号），REF 40-50035 或 REF 40-50036                             

3. 校准试剂：Luminex 100/200 Calibration Kit ，REF LX200-CAL-K25

4. 验证试剂：Luminex 100/200 Performance Verification Kit ，REF LX200-CON-K25

5. 70%  乙醇或 70%  异丙醇

6. 巴氏消毒液

需要但未提供的设备、耗材

1. 设备：

  多功能流式点阵仪 Luminex 200

  单道及多道移液器（推荐 eppendorf 或 RAININ） 

  磁力分离板（推荐 Magnetic Plate Separator ，REF CN-0269-01 ，Luminex）

    96 孔板水平涡旋混匀器（推荐精骐REFVM-02U，适配夹具 REFVMA06）

  涡旋振荡器

  恒温箱（37℃)

2. 耗材：

  移液器吸头（与移液器适配）

  离心管（1.5mL 或 2.0mL，低吸附）

    8/12 道移液器储液/加样槽。

需要但未提供的软件

配套分析软件：十三种肺癌相关抗体检测分析软件（版本号：V1.0，厂家：广州市丹蓝 生物科技有限公司，注册证号：*）

磁珠编码表：

【储存条件及有效期】

1.  未开封试剂盒：2～8℃避光储存，有效期为 12 个月。

2. 冻干组份：R6 校准品（冻干粉）、R7 质控品Ⅰ（冻干粉）、R8 质控品Ⅱ（冻干粉）、R9 偶联磁珠混合 物（冻干粉）按标示量复溶后于 2~8℃避光保存，12 小时内稳定。

3. 荧光二抗：R5 RPE-驴抗人 IgG 二抗浓缩液稀释至工作浓度后于室温（10~30℃) 避光保存，30min  内稳 定。考虑到溶液配制及试验时间因素建议 RPE-驴抗人 IgG 二抗工作液在临用前 15min配制。

4. 运输稳定性：未开封试剂盒按照上市包装进行冷链运输（2~8℃), 运输 6 天后按照货架保存条件储存， 不改变试剂盒的性能和有效期。

5. 生产日期及失效日期见产品包装标签。

【适用仪器】

本试剂盒适用机型为美国 Luminex  公司多功能流式点阵仪 Luminex  System，型号为 Luminex 200。

【样本要求】

1.  本试剂盒测试样本类型为血清，样本所需量为 10μL。

2.  采集静脉血不少于 1mL ，不抗凝，离心后常规分离得到血清。

3.  如果样本不立即检测，需 2～8℃（3 天内）或-20℃以下（一年内）保存。尽量采

用新鲜血清，避免反复冻融，反复冻融不应超过 3 次，室温（10~30℃) 下血清标本存放不超过 12 小时。

4.  溶血或脂血标本可能会对结果造成影响，建议重新采集送检。

5.  冷冻血清使用前应放 2~8℃环境自然融解，检测前充分混匀。

【检验方法】 准备工作

1.  实验前所有试剂平衡至室温（10~30℃),混匀。

2.  冻干粉复溶

将 R6  校准品（冻干粉）、R7  质控品 Ⅰ 、（冻干粉）、R8  质控品 Ⅱ（冻干粉）、R9  偶联 磁珠混合物（冻干粉）使用纯化水按标示量复溶，充分混匀备用。

注：试剂盒中冻干粉复溶后储存于 2～8℃, 不超过 12 小时。

3. 校准品的配制

取上述复溶后的校准品，用 R2 校准品稀释液按一定比例稀释至 600.00 U/mL，标记为 S1，参考如下 配制标准曲线：

标准曲线的配制

4. 检测样本的准备：检测样本恢复至室温，取 10µL，加入 R1 样本稀释液 240μL 稀释 25 倍，待用。

5. 工作洗涤液的稀释：将 R3 5×洗涤液与纯化水按照 1:4 进行混合，配制成工作洗涤液，待用。

6. RPE-驴抗人 IgG 二抗工作液的配制（临用前 15min 内）：吸取 80µL R5 RPE-驴抗人 IgG 荧光二抗浓缩液 和 3920µL R4 分析缓冲液（1：49），涡旋 10～15 秒混匀待用。

7. 在 Luminex 200 多功能流式点阵仪上读数的设置：Bead Type 为 MagPlex ，DD Gating 为 7500 to 15500， Acquisition Volume 为 60µL ，Count 为 100 per bead ；相应包被物及磁珠编号见磁珠编码表，上机请根据

《Luminex® 200™  系统使用手册》进行操作。

实验步骤

1.  加入 R9  偶联磁珠混合物（冻干粉）复溶液：

取出 96 孔板，参照下图的加样表布局，将 R9  偶联磁珠混合物（冻干粉）复溶液涡旋 30~60s 混匀后，加入 96 孔板内，50µL/孔：

1            2            3           4             5             6            …          …

A B C D E F

空白 s1   s2   s3   s4   s5

空白 s1   s2   s3   s4   s5

c Ⅰ c Ⅰ cⅡ cⅡ u1

u2

u5  u6  u7  u8  u9  u10

…

…

G H

s6 s7

s6 s7

u3 u4

u11 u12

注：1）空白为 R2 校准品稀释液；

2）c Ⅰ 、cⅡ分别为 R7 质控品 Ⅰ（冻干粉）复溶液和 R8 质控品Ⅱ（冻干粉）复溶液；

3）u1~u12 为待检样本。

2.  加样：在相应微孔中加入 50µL 校准品、质控品、稀释好的待测样本， 将 96 孔板 1000rpm 振荡 3min 后，贴封板膜，37℃静置孵育 90min。

3.  洗板：

1）将 96 孔板置于磁力板上扣好，静置 1min，保持 96 孔板固定于磁力板向上，迅速用 力向下翻转磁力板 180 ° , 甩掉孔内液体，保持磁力板垂直向下，用力快速甩动 3~4 次，直 至 96 孔板无液体滴落。

2）将 96 孔板从磁力板上取下，往 96 孔板各孔内加入 120µL  工作洗涤液，将 96 孔板 置于水平涡旋混匀器，室温 1000rpm 振荡 1min。

4.  重复上述步骤 3 洗板操作共 2 次。

5.  将 96 孔板置于磁力板上扣好，静置 1min，保持 96 孔板固定于磁力板向上，迅速有力向 下翻转磁力板 180 ° , 甩掉孔内液体，保持磁力板垂直向下，用力快速甩动3~4 次，直至 96 孔板无液体滴落。

6.  往各孔内加入 100μL RPE-驴抗人 IgG 二抗工作液（临用前 15min  内配制），96  孔板以 1000rpm 振荡 3min 混匀，贴封板膜，37℃静置孵育 60min。

7.  重复上述步骤 3 洗板操作共 2 次。

8.  将 96 孔板置于磁力板上扣好，静置 1min，保持 96 孔板固定于磁力板向上，迅速有力向 下翻转磁力板 180 ° , 甩掉孔内液体，保持磁力板垂直向下，用力快速甩动 3~4 次，直至 96 孔板无液体滴落。

9.  往各孔内加入 100μLR4 分析缓冲液，1000rpm 振荡 3min 后，上机读板。

10.  上机读板结束后，操作多功能流式点阵仪生成 13 种相关抗体的校准曲线并计算血清样 本中每种相关抗体的浓度。将相应数据输出保存为.csv  文件，导入本试剂盒配套分析软件， 分析、计算血清样本的 P 值（回归值）。当 P 值＜cut-off，则判定为“阴性”；当 P 值≥cut- off，则判定为“阳性”。

校准周期

仪器的校准和验证请按《Luminex®200™  系统使用手册》的要求进行。

本试剂盒采用 Logistic 5P 法，通过 7 点定标生成校准曲线，并选择 Fit of All Standards （符合所有标准点）进行曲线拟合计算。试剂盒附有校准品， 每次检测均需进行校准，按照 【检验方法】准备工作“3.”配制 S1~S7 后，随同样本一起检测，各校准品重复测定 2 次， 所获荧光值与理论浓度建立相应校准曲线。

质量控制

本试剂盒推荐每次随样本测定一次试剂盒中的高值和低值两个质控品，测值须控制在 预期范围内（每批产品的质控品I、质控品 II 的预期范围见附表：校准品、质控品标示范围 表，也可根据适当内部实验室质量控制方案自行设定预期范围）。如果测值偏离预期范围，

请检查仪器状况、操作程序和试剂情况，在查明原因并解决问题后重新测量标本。

【阳性判断值】

通过对 1065 例样本的 13 种肺癌相关抗体检测结果进行分析，建立了 13 种指标联合判 定的二元 Logistic  回归模型，并采用受试者工作特征曲线（ROC）方法确定临界值（cut- off=0.70727），取 cut-off=0.70727 时，对肺癌的诊断灵敏度为 64.60%，特异性为 80.06%。

【检验结果的解释】

1. 将样本的 13  种肺癌相关抗体检测结果导入十三种肺癌相关抗体检测分析软件，通过 13 个检测指标联合判定的二元 Logistic 回归模型计算样本的 P 值（回归值）。本试剂盒的阳性 判断值 cut-off=0.70727，当 P＜0.70727 时判定为阴性，当 P≥0.70727 时判定为阳性。P 值 计算公式如下：

其中：

X= -0.087856+

0.000465*TM4SF1+0.000115*p53+0.000087*pGp9.5+0.000055*SOX2+0.000027*BMI1- 0.000002*FXR1+0.000149*MAGE A4+0.000203*ESO1-0.000468*ZNF573+

0.000388*BRAF+0.000011*GBU4-5-0.000017*EFHD2+0.000028*CAGE

2.  复测要求

如样本中某肺癌相关抗体浓度超出线性范围上限或低于检出限，需在实验结束后对该 相关抗体进行复测，超出线性区间上限推荐在原有稀释基础上再稀释 2~128 倍，确保结果 落在线性范围内，低于检出限建议直接对样本稀释 2~10 倍进行检测，使结果高于检出限。

【检验方法的局限性】

1.  检测结果可能存在假阳性与假阴性，检测结果阳性不作为肺癌的确诊证据，检测结果阴 性也不能完全排除肺癌的可能性，本试剂的检测结果仅供临床医生提供参考，对患者的临 床诊治应结合其症状、体征、病史、影像学检查及其他实验室检测综合判断。

2.  某些肿瘤的发生、转移具有与肺癌相似的机制，因此检测结果为阳性时亦不能排除患其 它肿瘤的可能。

3.  虽然在试剂盒中加入了抗病人血清的异嗜性抗体干扰的组分，仍不能排除有部分病人血 清仍存在上述物质的干扰。

4.  本产品为定性检测试剂。由于方法学差异或抗体特异性不同等因素，其他试剂所得检测 结果不应直接与本试剂盒的检测结果进行比较，以免造成错误的医学解释。

【产品性能指标】

1. 线性

在 1.23~600U/mL  范围内，十三种肺癌相关抗体检测结果的线性相关系数（r）均应不 低于 0.9900。

2. 检出限

十三种肺癌相关抗体的检出限均应不高于 1.23U/mL

3. 准确度

3.1 阳性参考品符合率

检测 6 份阳性参考品，均应为阳性。

3.2 阴性参考品符合率

检测 10 份阴性参考品，均应为阴性。

3.3 回收率

检测十三种肺癌相关抗体的准确度参考品，各指标的回收率均应在 80.0%～120.0%范 围内。

4. 重复性

重复检测高、低浓度精密度参考品各 10 次，各指标浓度值变异系数（CV）均应不大于 15.0%，且高浓度精密度参考品均应为阳性，低浓度精密度参考品均应为阴性。

5. 批间差

用 3 个批号试剂盒分别检测高、低浓度精密度参考品，各指标浓度值的批间变异系数 （CV）均应不大于 20.0％。

6. 高剂量钩状效应

本产品 13 种相关抗体浓度在下表所示的样本浓度限值内，未观察到高剂量钩状效应 现象。

13 种相关抗体的浓度限值

7. 分析特异性

本产品通过测试以下浓度的干扰物，结果不受影响：

名称                     测试浓度

甘油三酯

人血红蛋白

胆红素

抗坏血酸

10ml

10mg/mL

1.5mM

50µg/mL

本产品通过测试以下物质浓度的交叉反应，结果不受影响：

8. 临床试验

本次临床试验共在 3 家临床机构开展，临床试验共计入组有效受试者 1463 例，本试剂 盒检测结果与临床参考标准进行对比，针对肺癌患者诊断灵敏度为 67.25%，特异度为 85.50%。

【注意事项】

1.  本产品仅用于体外诊断。

2.  本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他 实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

3.  该产品中含有人源或动物源性物质，操作者应采取必要防护措施。

4.  所有样本和反应废弃物都应视为传染源对待，操作者应按实验室管理规范执行。

5.  产品性能仅针对声称的适用样本类型及【样本要求】中说明的样本采集、处理和保存方法进行了验证， 其他样本类型或样本采集、处理和保存方法不能保证产品性能。

【标识的解释】

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【基本信息】

注册人/生产企业名称：广州市丹蓝生物科技有限公司 住所：广州国际生物岛螺旋三路 8 号第一层 102 单元 联系方式：

售后服务单位名称： 联系方式：

生产地址：广州国际生物岛螺旋三路 8 号第一层 102 单元 生产许可证编号：

【医疗器械注册证编号/产品技术要求编号】 【说明书批准日期/生效日期及修改日期】