人 Twist1 基因甲基化检测试剂盒（荧光 PCR 法）体外诊断试剂产品注册技术审评报告

体外诊断试剂产品注册技术审评报告 

产品中文名称： 人 Twist1 基因甲基化检测试剂盒（荧光 PCR 法） 

产品管理类别： 第三类 

申请人名称 ： 安徽达健医学科技有限公司 

国家药品监督管理局 

医疗器械技术审评中心

目 录 

基本信息 ............................................... 3 

一、申请人名称 ......................................... 3 

二、申请人住所 ......................................... 3

三、生产地址 ........................................... 3 

技术审评概述 ........................................... 4

一、产品概述 ........................................... 4 

二、临床前研究概述 ..................................... 7 

三、临床评价概述 ...................................... 12 

四、产品受益风险判定 .................................. 13

综合评价意见 .......................................... 16

基本信息 

一、申请人名称  

安徽达健医学科技有限公司 

二、申请人住所  

芜湖经济技术开发区东区 9#厂房（中科芜湖科技园公司内） 

三、生产地址  

芜湖经济技术开发区东区 9#厂房（中科芜湖科技园公司内）

技术审评概述 

一、产品概述  

（一）产品主要组成成分  

试剂盒 I：亚硫酸氢盐转化试剂盒（离心柱型）

试剂盒 II：PCR 扩增试剂盒

注：不同批号的试剂盒中各组分不可以互换使用。具体内 容详见产品说明书。

（二）产品预期用途  

本试剂盒用于体外定性检测尿脱落细胞中膀胱癌相关 Twist1 基因甲基化状态。

本产品用于初诊膀胱癌的辅助诊断。 

膀胱癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，也是引起泌尿 系统肿瘤患者死亡的第二大肿瘤，早期发现膀胱癌可以增 加手术保留膀胱的机会并提高患者总体生存率。研究发现 可以在膀胱癌组织和患者尿液中检测到膀胱癌相关 Twist1 基因存在过度甲基化，检测 Twist1 基因甲基化状态可以用 于初诊膀胱癌的辅助诊断。

本试剂盒采用甲基化特异性实时荧光 PCR 法检测尿脱 落细胞中膀胱癌相关 Twist1 基因的甲基化状态，是一种初 诊膀胱癌辅助诊断方法。本试剂盒适用于血尿、尿频、尿 急和尿痛等临床上疑似膀胱癌、临床诊断建议进行膀胱镜 检查患者的辅助诊断。本产品仅作为现有诊断方法的补充 和辅助，供临床医师参考。

（三）产品包装规格  

20 人份/盒、50 人份/盒 

（四）产品检验原理  

本产品包括两个步骤： 

步骤I，用试剂盒I将提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转 化，未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的嘧啶不变。 

步骤II，将亚硫酸氢盐转化的DNA（Bis-DNA）做PCR扩增， 试剂中含有膀胱癌相关Twist1基因甲基化特异性引物探针 和内标基因（GAPDH）引物探针。甲基化特异性引物探针能与 膀胱癌相关甲基化Twist1基因序列特异性结合，可以在PCR 反应中特异地检测出甲基化序列。同时，内标基因（GAPDH） 可监控每个样本的提取及PCR反应管的扩增情况，从而避假阴性或部分抑制结果的发生。另外，试剂盒还提供了阳性 对照品和阴性对照品，需在每一次检测中同时加入。

二、临床前研究概述  

（一）主要原材料  

1．主要原材料的选择 

本产品的主要原材料包括 dNTP、Taq 酶、亚硫酸氢盐、 引物和探针。这些原材料均是通过外购的方式获得。 

其中引物、探针的序列由申请人自行设计，由合成公司 经过合成、修饰、纯化方式获得；Taq 酶由原材料供应商克 隆表达后获得；dNTP、亚硫酸氢盐由供应商化学合成获得。 

申请人对主要原材料进行了供应商的选择，通过功能性 试验筛选出合格供应商，制定了主要原材料的技术要求和质 量标准并经检验合格。

2．企业参考品和质控品设置情况 

本产品企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、精密 度参考品以及检出限参考品。 

企业参考品包括 Twist1 基因相应位点甲基化阳性的样本，这些样本 Twist1 基因的甲基化状态均经过数字 PCR 方 法验证。 

阳性参考品包括 3 种，分别命名为阳性参考品 P1-P3， 为一定 DNA 浓度下 Twist1 基因不同甲基化比例的样本。 

阴性参考品包括 4 种，分别命名为阴性参考品 N1-N4， 其中 N1 为一定浓度下含有低于检出限的甲基化 Twist1 基因样本，N2-N4 为一定浓度下分别含有其它不同肿瘤相关的 基因甲基化的样本。 

精密度参考品包括 3 种，分别命名为 J1-J3，其中 J1 为 非膀胱癌患者样本，J2 和 J3 为一定 DNA 浓度下 Twist1 基因 不同甲基化比例的样本。 

检出限参考品包括 3 种，分别命名为 L1-L3，为一定低 甲基化比例下不同浓度的样本。 

本试剂盒同时设置了阳性对照和阴性对照，用于检测过 程中的试剂和仪器的质量控制。此外，每个样本均检测内参 基因 GAPDH，用于结果的判读及评估样本的质量。

（二）生产工艺及反应体系研究  

申请人对试剂盒反应体系的研究包括引物探针浓度的 确定、DNA 聚合酶用量的确定、PCR 缓冲液用量的确定、镁 离子浓度的确定、dNTP 浓度的确定、PCR 反应体积的确定、 PCR 模板体积的确定、转化液用量的确定、缓冲液浓度的确 定、结合液浓度的确定、脱磺液浓度的确定等；对 PCR 反应 条件的研究包括退火温度及时间、预变性温度及时间、变性 时间、循环数等。通过功能性实验，最终确定了最佳反应体系。 

申请人根据试剂盒中试剂及组件的主要生产工艺的研 究结果，确定了最佳的生产工艺。

（三）分析性能评估

本产品分析性能评估内容包括准确度、精密度、检出限、 分析特异性、企业参考品的符合性、不同规格性能研究、亚硫酸氢盐转化效率等研究。

准确度研究中，申请人选择了若干临床尿液样本对试剂 盒的检测准确性进行研究，研究结果显示试剂盒检测结果与 测序结果阳性符合率为 100%、阴性符合率为 96.67%。 

精密度研究中，申请人使用精密度参考品，分别用三批 次试剂盒由两位操作者在 20 天进行连续的检测。结果显示 试剂盒对精密度参考品的批内、日间、批间、仪器、人员和 地点间的检测变异系数均小于等于 5%。

检出限研究中，以阴性尿液样本为基质，采用不同浓度、 不同甲基化比例的模拟样本，每个浓度梯度的样本检测 20 次 进行检出限的确认。使用连续生产的三个批次的试剂盒，用 多例真实临床样本在检出限浓度水平上进行检出限的验证。 明确了试剂盒的检出限为 5ng/uL 的野生型 DNA 背景下，5% 的 Twist1 甲基化 DNA。 

分析特异性研究包含交叉反应和干扰研究，交叉反应研 究包括其它基因甲基化的样本、转化前尿液样本、常见尿道 微生物样本，均无交叉反应；用三批试剂盒检测其它恶行肿 瘤患者尿液样本，包括肝癌、胃癌、肾细胞癌、前列腺癌， 结果显示均无交叉反应。在上尿路肿瘤特异性研究中，检测结果显示试剂盒对上尿路肿瘤（输尿管癌、肾盂癌）有一定 的阳性检出率，试剂盒检测结果与测序结果完全一致。

干扰试验结果显示，尿液中分别含有以下干扰物：尿酸 （1.4mmol/L）、葡萄糖（55mmol/L）、抗坏血酸（170μmol/L）、 白蛋白（60g/L）、酮体（12mmol/L）、尿胆原（10.65μmol/L）、 亚硝酸盐（120mg/L）、pH 为 8.0、氨（107μmol/L）、甘油 三酯（37mmol/L）、血红素（2g/L）、维生素 C（170μmol/L）， 常用药物如盐酸左氧氟沙星（1.08g/L）、四环素（780mg/L）、 青霉素（27g/L）、头孢克肟（426.6mg/L）、布洛芬胶囊 （478.8mg/L）、感冒灵胶囊（9g/L）对检测结果无影响。膀 胱癌常用灌注治疗药物卡介苗（360mg/L）、丝裂霉素 （120mg/L），表柔比星（150mg/L）会影响检测的敏感性， 因此接受化疗药物治疗后 1 个月内勿留样检测。

企业参考品的符合性研究中，申请人分别使用三批试剂 盒对阳性参考品和阴性参考品进行检测，检测结果显示阳性 符合率、阴性符合率均为 100%。 

申请人采用临床尿液样本进行了核酸提取试剂盒性能 研究，并根据与该产品的组合性能研究结果，确定推荐的核 酸提取试剂符合检测要求。

（四）阳性判断值或参考区间研究  

本产品阳性判断值的研究采用真实尿液样本。阳性判断 值研究入组（包括建立和验证）有效样本数共计 164 例，样本来源包括膀胱癌患者、肾细胞癌患者、前列腺癌患者、输 尿管癌患者、肾盂癌患者、输尿管炎、尿路上皮增生、膀胱 无病变人群等。 

采用百分位数法确定内标基因的 Ct 值的范围，内标基 因 Ct 值≤25 时判定样本合格。采用 ROC 曲线法和约登指数 确定试剂盒阳性判断值为10。当ΔCt值≤10时判断为阳性， ΔCt 值＞10 时判断为阴性。

（五）稳定性研究  

申请人对该产品的稳定性研究包括货架效期稳定性、运 输稳定性、使用稳定性（包括开瓶稳定性、冻融稳定性）及 样本稳定性（包括尿液、尿液提取 DNA 及尿液提取转化后 DNA 的稳定性）。 

货架有效期稳定性：将三批试剂盒置于规定储存条件下 放置 0、2、4、6、8 个月，每到一个时间节点使用企业参考 品对试剂盒的性能进行检测，结果显示试剂盒在生产后保至 8 个月各项性能指标均符合产品技术要求，产品有效期可 达 6 个月。 

此外，申请人对产品的运输稳定性、使用稳定性和样本 稳定性分别进行了研究。结果显示，产品的性能均能满足产 品说明书的声称。

三、临床评价概述  

本产品在中山大学肿瘤防治中心、哈尔滨医科大学附属 肿瘤医院、蚌埠医学院第一附属医院三家临床试验机构进行 临床试验，采用试验体外诊断试剂与临床参考标准进行比较 研究，确认本产品的临床性能。其中，膀胱癌和其它肿瘤病 例采用病理诊断确诊，其它疾病根据相关诊疗指南进行综合 诊断确诊。入组病例为膀胱癌的疑似病例，样本类型为尿液。 

产品临床灵敏度和特异度评价共纳入临床有效病例 1233 例，其中膀胱癌病例 348 例（覆盖膀胱癌所有分期及病 理分型），非膀胱癌的其它病例 885 例（包括其它易产生干 扰的肿瘤及各种良性疾病病例）。试验结果显示：本产品临 床灵敏度为 88.2%（95%CI：84.4% - 91.2%），特异度为 86. 8%（95%CI：84.4% - 88.9%），总符合率为 87.2%（95%CI： 85.2% - 88.9%）。上述结果显示试验体外诊断试剂具有较好 的临床灵敏度和特异度，满足临床使用需求。

此外，临床试验还纳入 254 例膀胱癌疑似病例，采用试 验体外诊断试剂与测序进行比较研究，确认本产品的临床检 测性能。试验结果显示：阳性符合率为 100%（95%CI：93.2% - 100%），阴性符合率为 99%（95%CI：96.5% - 99.7%）， 总符合率为 99.2%（95%CI：97.2% - 99.8%）。上述结果显示两者之间具有良好的一致性，本产品临床检测性能满足要求。

综上所述，临床试验结果显示本产品的临床性能满足技 术审评要求。

四、产品受益风险判定  

根据 YY/T 0316-2016《医疗器械 风险管理对医疗器械 的应用》对人 Twist1 基因甲基化检测试剂盒（荧光 PCR 法）进行产品受益风险判定。 

（一）受益评估  

该产品适用于临床上疑似膀胱癌、临床诊断建议进行膀 胱镜检查患者的辅助诊断，不能作为膀胱癌早期诊断或确诊 的依据，检查结果仅供临床参考，具体临床应用时，临床医 生必须结合病例实际情况判断。其临床应用的主要受益在于： 该产品为临床上疑似膀胱癌、临床建议进行膀胱镜检查的患 者提供了一种膀胱癌辅助诊断方法的选择，检查结果为阳性 的患者体内有膀胱癌的可能性大，从而促进这部分人群顺应 膀胱镜检查，获得及时的诊断和治疗。依据现有的临床试验 结果，其对膀胱癌的检查灵敏度为 88.2%，特异度为 86.8%。

（二）风险评估  

该试剂盒已知和可预见的安全风险主要有以下几个方面：

1．与预期用途有关的风险，例如本产品不能作为膀胱 癌早期诊断或确诊的依据，临床医生未结合其它诊断方法进 行综合诊断。 

2．与生产过程相关的风险，例如说明书印刷错误。 

3．与储存或运输相关的风险，例如在不正确的储存和 运输条件下储存、运输试剂。

4．与使用有关的风险，例如使用非推荐的提取试剂或 荧光定量 PCR 仪。

5．生物危险，例如使用后或失效的产品直接丢弃或产 品使用过程中产生的废弃物未按照要求按医疗废弃物统销毁处理。 

通过对人 Twist1 基因甲基化检测试剂盒（荧光 PCR 法） 从生产原料、配制、检测、标志、包装、运输、储存、使用 方法及安全注意事项、保存和使用处理等全过程危害判定、 风险评估、预防化解，从产品技术要求和使用说明书及企业 规章制度对产品质量的全过程控制和风险防控措施，已将产 品的风险系数降低到了验收准则规定的可接受范围内，同时 采取降低风险的措施后没有引入新的风险。在目前认知水平 上，认为该产品上市带来的受益大于风险。

尽管目前认为该试剂盒的受益大于风险，但是为保障用 械安全，基于对主要剩余风险的控制已在该试剂盒说明书提示以下信息：

1．预期用途 本试剂盒用于体外定性检测尿脱落细胞中 Twist1 基因 甲基化。 

本产品用于初诊膀胱癌的辅助诊断。 

该产品适用于临床上疑似膀胱癌、临床诊断建议进行膀 胱镜检查患者的辅助诊断，不能作为膀胱癌早期诊断或确诊 的依据。检查结果仅供临床参考，具体临床应用时，临床生必须结合病例实际情况判断。阳性结果需要进一步接受膀 胱镜检查；阴性结果表示受检者体内有膀胱癌的可能性低， 但并不能完全排除疾病风险，必要时仍建议进行膀胱镜检查本产品不能替代膀胱镜，不能用于普通人群的膀胱癌筛查。 

2．警示及注意事项：该试剂盒说明书中明确了该试剂盒检查方法的局限性及使用中的注意事项。

综合评价意见  

本申报项目为境内第三类医疗器械产品注册，属于境 内同品种首个产品。申请人的注册申报资料符合现行要 求，依据《医疗器械监督管理条例》（中华人民共和国国 务院令 第 739 号）、《体外诊断试剂注册管理办法》 （原国家食品药品监督管理总局令 2014 年第 5 号）等相 关医疗器械法规与配套规章，经系统评价后，建议准予注 册。 

2022 年 9 月 28 日