人类SMN1和SMN2基因检测试剂盒（PCR-毛细管电泳法）（CSZ2400022）

受理号：CSZ2400022

体外诊断试剂产品注册技术审评报告

                                              产品中文名称：人类 SMN1 和 SMN2 基因检测试剂盒（PCR- 毛细管电泳法）

产品管理类别： 第三类

申 请 人 名称： 厦门百欧迅生物科技有限公司

国家药品监督管理局  医疗器械技术审评中心

目  录

基本信息  3

一、申请人名称 3

二、申请人住所 3

三、生产地址  3

技术审评概述 4

一、产品概述  4

二、临床前研究概述 6

三、临床评价概述  12

四、产品受益风险判定  14

综合评价意见 17

基本信息

一、申请人名称

厦门百欧迅生物科技有限公司

二、申请人住所

厦门市海沧区翁角西路 2032 号厦门生物医药产业园 A17 号楼 4 层之二

三、生产地址

厦门市海沧区翁角西路 2032 号厦门生物医药产业园 A17 号 楼

技术审评概述

一、产品概述

（一）产品主要组成成分

本试剂盒含有 SMA 反应液、SMA 引物混合液、酶 C、SMA 正 常对照、SMA 质控品 1、SMA 质控品 2、和 SMA 空白对照，详见 表 1。

表 1 产品主要组成成分

（二）产品预期用途

本试剂盒用于体外检测EDTA 抗凝全血样本中人运动神经元 存活基因 1 （ SMN1）和运动神经元存活基因 2（SMN2）第 7 号 外显子和第 8 号外显子的拷贝数（ 0、1、2、3、≥4）。SMN1 基

因拷贝数用于脊髓性肌萎缩症（ spinal muscular atrophy，SMA） 的辅助诊断，SMN2 基因拷贝数用于 SMA 患者分型的辅助判断， 检测结果供临床参考，临床医生应结合患者临床表现进行综合  判断。

脊髓性肌萎缩症（SMA）为一种常染色体隐性遗传疾病，临 床特征为脊髓前角运动神经元退化凋亡导致对称性肌无力和肌 萎缩。其病因是由于位于 5 号染色体上的运动神经元存活基因 1 （ Survival of Motor Neuron 1, SMN1 ）突变所致。正常人至 少有 2 拷贝正常的 SMN1 基因，携带者仅 1 条 5 号染色体上有正 常 SMN1 基因，而 SMA 患者没有正常 SMN1 基因，即 0 拷贝正常 SMN1 基因。

SMN1 突变包括第 7 号和/或第 8 号外显子缺失以及点突变等 类 型 ， 其 中 95% 以 上 为 缺 失 所 致 。 该 病 发 病 率 约 为 1/10,000-1/6,000，人群携带率为 1/50-1/40。与 SMN1 高度同 源的运动神经元存活基因 2（ Survival of Motor Neuron 2, SMN2），两基因序列上仅有 5 个碱基的差异，其中 2 个碱基位于 第 7、8 号外显子上，另 3 个碱基则位于内含子 6、7 中，因 SMN2 第 7 号外显子（ c.840T）破坏了一个外显子剪接增强子（ exonic splicing enhancer ），导致只有少量的全长 SMN mRNA 生成， 使得功能性 SMN 蛋白的表现量减少。SMN2 为临床表型的调节基

因，影响病情的严重程度，其拷贝数增加可减轻 SMA 患者表型 症状。因此，检测 SMN2 基因的拷贝数有助于为疾病分型提供参 考依据。

（三）产品包装规格

48 测试/盒，96 测试/盒。

（四）产品检验原理

本试剂盒采用荧光PCR-毛细管电泳法，针对人类 SMN1、SMN2 基因第 7 号外显子和第 8 号外显子设计特异性的引物，区分 SMN1 和 SMN2。以 HBB 与 ACTB 基因为内标基因，监控 PCR 反应效率， 通过 SMN1 与 SMN2 皆为 2 拷贝数的对照品，对 SMN1、SMN2 基因 拷贝数进行相对定量的检测，区分 0、1、2、3、≥4 拷贝的 SMN1 与 SMN2 基因。

二、临床前研究概述

（一）主要原材料

本产品的主要原材料包括引物、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、 热启动核酸聚合酶，均为外购。通过功能性试验， 申请人筛选 出最佳原材料和供应商， 同时制定了各主要原材料质量标准并 经检验合格。

试剂盒设置有 SMA 正常对照、SMA 质控品 1、SMA 质控品 2， 主要原料为质粒 DNA， 以上质粒 DNA 内含 SMN1 第 7 号外显子和

第 8 号外显子基因、SMN2 第 7 号外显子和第 8 号外显子基因、 ACTB 基因、HBB 基因，SMA 空白对照主要原料为 10mM Tris 8.5 溶液，并按照相应的质量标准进行检测合格后使用。

本产品的企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、精密 度参考品及检测限参考品。企业参考品采用临床血液样本或细 胞系进行提取的基因组 DNA 制备，并以 SMA 检测金标准荷兰 MRC-Holland 公司研制的 SALSA®  MLPA®  Probemix P021-B1 SMA 确认其基因拷贝数。

（二）生产工艺及反应体系研究

本试剂盒的反应体系的研究包括 PCR 反应液中各组份配方 与用量的调整、DNA 酶用量的确定；对 PCR 反应条件的研究包括 退火温度、扩增循环数、扩增循环数中各阶段时间、最后延伸 时间的测试；毛细管电泳的上机程序进行测试调整；确认 PCR 过程的质量控制，包含内控基因设计、拷贝数计算公式的确认； 完成样本提取 DNA 纯度、浓度以及重复性和反应投入量研究， 并对产品适配的 PCR 仪和毛细管电泳仪 Applied Biosystems®  3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers 的检测结果进行研究。

根据试剂盒中试剂及组件的主要生产工艺的研究结果，确 定了最佳的生产工艺。

（三）分析性能评估

本产品分析性能评估内容包括准确度、精密度、最低检测 限、分析特异性和提取试剂性能的研究。

1.准确度

准确度研究使用共检测 43 例覆盖 SMN1 和 SMN2 基因各不同 拷贝数（ 0、1、2、3、≥ 4）的临床 EDTA 抗凝全血样本，使用 三批次的试剂盒进行检测，均能准确检测 SMN1 和 SMN2 不同拷 贝数（ 0、1、2、3、≥ 4）组合的样本，包含纯合缺失型、杂合 缺失型和无缺失型相应的拷贝数，检测符合率 100%。

2.精密度

精密度研究使用不同拷贝数组合的临床样本，提取后在低 与中高浓度水平进行检测。分别考察室内精密度、试剂盒批内 与批间精密度、操作人员间精密度、实验室间精密度，结果表 明各项不精密度变异系数均不大于 10%。

3.最低检测限

在最低检测限建立的研究中，首先使用 SMN1 和 SMN2 基因 各不同拷贝数（ 0、1、2、3、≥ 4）的临床 EDTA 抗凝全血样本， 提取基因组 DNA，梯度稀释 DNA 样本各进行 3 次重复平行检测， 对检测限进行初步考察；根据预估检测限的最高与最低浓度附 近设置若干浓度梯度，以三批次试剂对每个浓度重复 20 次检测， 最终以 60ng/ μL 、15ng/ μL 分别做为最高与最低检测限。

在最低检测限验证的研究中，另取 SMN1 和 SMN2 基因各不 同拷贝数（ 0、1、2、3、≥ 4）的临床 EDTA 抗凝全血样本，提 取基因组 DNA，将 DNA 样本分别稀释至 60ng/ μL 、15ng/ μL， 各进行 20 重复平行检测，检出率为 100%。

4.分析特异性

在干扰试验中， 申请人对内源性干扰物质与常见治疗药物 进行评价。结果显示：人 EDTA 抗凝全血样本中常见的干扰物质， 如三酸甘油酯（ 500mg/dL ）、胆红素（ 15mg/dL ）、血红蛋白 （ 20g/dL）、白蛋白（ 60g/L）、EDTA 抗凝剂（6μmole/L），与常 见治疗药物， 诺西那生（ 5mg/mL）、利司扑兰（ 400ng/mL）、沙 丁胺醇（ 3μmole/L ）、阿莫西林（ 400μmole/L ）、头孢氨 苄 （ 600μmole/L ）、乙酰胺基酚（ 3000μmole/L ）、甲氧氯普胺 （ 3μmole/L）与奥美拉唑（40μmole/L），对本试剂盒检测结果 均不造成影响。

交叉反应评价中， 申请人针对全血样本中常见的病原体进 行研究，包括乙肝病毒、 丙肝病毒、巨细胞病毒、肠道病毒 71 型，对本试剂盒检测结果不造成影响。使用高拷贝的 SMN2 对 SMN1 不同拷贝数样本进行交叉反应；高拷贝的 SMN1 对不同拷贝 数 SMN2 的进行交叉反应研究，结果显示 SMN1 和 SMN2 基因不会 对各自的检测结果造成影响。针对与 SMA 症状类似的疾病，如

Duchenne 型肌营养不良（DMD）、Becker 型肌营养不良（BMD） 进行交叉反应评价，对本试剂盒检测结果均不造成影响。针对 SMN 基因微小突变或者基因多型性位点进行研究，包括 SMN1 基 因的微小突变 c.22dupA、c.81+2_3delTG、c.683T>A，SMN1 基 因第 7 号外显子基因多型性 rs555928635、SMN2 基因第 8 号外 显子基因多型性 rs576032516，对本试剂盒检测结果均不造成影 响。

5.提取试剂性能研究

采用临床样本进行了核酸提取试剂盒性能的研究，根据与 该产品的组合性能研究结果，确定推荐的核酸提取试剂符合检 测需求。

（四）阳性判断值研究

阳性判断值研究首先采用 714 例已知基因型的临床样本进 行检测， 同时使用 SMA 检测标准方法 MLPA 确认其基因拷贝数， 采用 ROC 曲线法对本试剂盒的阳性判断值进行研究。最终确定 阳性判断值按下表进行判读：

采用另外一批 168 例经 SMA 检测标准方法 MLPA 检测的临床 样本进行验证，检测结果与 MLPA 确认结果一致。

（五）稳定性研究

申请人对本产品在实际储存条件下保存至成品有效期后的 实时稳定性、使用稳定性等进行了研究，确定了在各种条件下 试剂的有效保存时间。

实时稳定性：三批试剂放置于-20±5℃保存，按时间考察每 批试剂盒在第 0、3、6、9、12、14、18、19 个月的性能，检测 其外观、阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、检测限与精 密度，结果均符合要求；确定本试剂有效期为 18 个月。

使用稳定性：考察试剂开瓶后在 2～ 8℃   5 天内、-20±5℃ 在试剂盒效期内及反复冻融 7 次的性能，结果显示：产品外观 符合要求，阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品与精密度 参考品均符合要求。为确保产品性能稳定，要求本试剂盒在首

次使用后，应尽快用完，如需长期保存，再次放置于-20±5℃可 保存至有效期产品性能稳定，但应避免反复冻融（不超过 6 次）。

此外，申请人对产品的样本稳定性进行了研究。结果显示， 产品性能均能满足产品说明书声称要求。

三、临床评价概述

本产品在浙江大学医学院附属儿童医院、深圳市儿童医院、 湖南省儿童医院、南京市妇幼保健院、广州医科大学附属第三 医院共五家临床试验机构进行临床试验，临床试验入组病例为 疑似或确诊脊髓性肌萎缩症（SMA）的病例等，共入组病例 975 例。

（一）采用试验体外诊断试剂与临床参考方法 MLPA 方法进 行比较研究，确认本产品的临床检测性能。

1.针对 SMN1 检测性能：临床参考方法检测结果为 SMN1 基 因外显子 7 缺失阳性（拷贝数为 0 或 1）471 例，临床参考方法 检测 SMN1 基因外显子 7 缺失阴性（拷贝数为 2 及以上）504 例， 其中 0 拷贝 253 例，1 拷贝 218 例，2 拷贝 480 例，3 拷贝 23 例，4 拷贝 1 例。试验结果显示：本产品阳性符合率为 100% （ 95%CI：99.19%，100%），阴性符合率为 100%（ 95%CI：99.24%， 100%）。临床参考方法检测结果为 SMN1 基因外显子 8 缺失阳性 452 例，临床参考方法检测 SMN1 基因外显子 8 缺失阴性 523 例，

其中 0 拷贝 225 例，1 拷贝 227 例，2 拷贝 487 例，3 拷贝 33 例，4 拷贝 3 例。试验结果显示：本产品阳性符合率为 100% （ 95%CI：99.16%，100%），阴性符合率为 100%（ 95%CI：99.27%， 100%）。

2.针对 SMN2 检测性能：临床参考方法检测结果为 SMN2 外 显子 7 拷贝数 0、1、2、3、≥ 4 病例数分别为 33 例、176 例、 430 例、304 例、32 例；SMN2 外显子 8 拷贝数 0、1、2、3、≥ 4 病例数分别为 38 例、191 例、440 例、280 例、26 例。试验结 果显示：试验体外诊断试剂与参考方法符合率 100%。

上述结果显示试验体外诊断试剂与临床参考方法检测结 果具有较好的一致性。

（ 二）针对 SMA 的辅助诊断用途的评价：

采用试验体外诊断试剂与 SMA 的临床诊断结果进行了比较 研究，确认本产品的临床性能。临床诊断结果为 SMA 病例 269 例，非 SMA 病例 706 例，试验结果显示：灵敏度为 94.05%（ 95%CI： 90.56%，96.31%）；特异度为 100%（ 95%CI：99.46%，100%）；针 对不一致的样本进行了充分分析和确认，其中假阴性的 14 例患 者中，12 例为复合杂合突变型，SMN1 基因外显子 7 为杂合缺失， 1 例患者在临床试验前有异基因非亲缘脐带血回输，1 例为 SMN1 双等位基因均为微小致病性变异[1d+1d]型 SMA 患者；假阳性样

本 2 例，该 2 例患者经随访确诊为 SMA 患者。上述结果显示两 者之间具有良好的一致性，本产品针对 SMA 辅助诊断的临床性 能满足要求。

（三）针对 SMN2 基因拷贝数用于 SMA 患者分型的辅助判断 的评价：

共纳入有明确分型的 SMA 患者 249 例，包括 1 型、2 型、3 型和 4 型，针对试验体外诊断试剂对 SMN2 不同拷贝数（ 2 拷贝、 3 拷贝、≥4 拷贝）的检测结果与 SMA 患者分型的关系进行了分 析，两者有较好的相关性。结果显示，本产品针对 SMA 分型辅 助判断的临床性能满足要求。

综上所述，临床试验结果显示本产品的临床性能满足技术 审评要求。

四、产品受益风险判定

依据“YY/T 0316-2016  《医疗器械风险管理对医疗器械的 应用》，对该产品进行风险分析

（ 一）受益评估

本产品适用本产品适用于 EDTA抗凝全血样本中人运动神经 元存活基因 1 （ SMN1）和运动神经元存活基因 2（SMN2）第 7 号外显子和第 8 号外显子拷贝数（ 0、1、2、3、≥ 4）的检测， SMN1 基 因拷 贝 数用 于脊髓性肌 萎缩症（ spinal muscular

atrophy，SMA）的辅助诊断，SMN2 基因拷贝数用于 SMA 患者分 型的辅助判断，检测结果仅供临床参考，具体临床应用时， 临 床医生必须结合病例实际情况判读。本产品临床应用的主要受 益在于：可作为脊髓性肌萎缩症的辅助诊断以及 SMA 患者分型 的辅助判断的方法。

（二）风险评估

申请人对已知危险（源）进行风险评价，按照风险可接受 准则判断每个危险（源） 的风险是否达到可接受水平，对合理 可行降低的风险、不经过风险/收益分析既判定为不可接受的风 险采取控制措施，并对具体措施进行实施验证，同时重新对采 取措施后的风险进行估计，确认其风险水平是否可接受。但为 保证用械安全，基于对主要剩余风险的规避，需要在说明书中 提示以下信息：

1.预期用途：用于体外检测 EDTA 抗凝全血样本中人运动神 经元存活基因 1 （ SMN1）和运动神经元存活基因 2（SMN2）第 7 号外显子和第 8 号外显子拷贝数（ 0、1、2、3、≥4）的检测， SMN1 基 因拷 贝 数用 于脊髓性肌 萎缩症（ spinal muscular atrophy，SMA）的辅助诊断，SMN2 基因拷贝数用于 SMA 患者分 型的辅助判断，检测结果供临床参考，临床医生应结合患者临 床表现进行综合判断。

2.警示及注意事项：产品说明中明确了该产品检验方法的 局限性及使用中的注意事项。

综合评价意见

本申报项目为境内第三类体外诊断试剂产品注册。依据《医 疗器械监督管理条例》（国务院令第 739 号）、《体外诊断试剂 注册与备案管理办法》（国家市场监督管理总局令第 48 号）等 相关医疗器械法规与配套规章，经对申请人提交的注册申报资 料进行系统评价, 申报产品符合安全性、有效性的要求，符合 现有认知水平，建议准予注册。

2025 年 5 月 20 日

附件：产品说明书

【产品名称】

人类 SMN1 和 SMN2 基因检测试剂盒（荧光 PCR-毛细管电泳法）

【包装规格】

48 测试/盒；96  测试/盒

【预期用途】

本试剂盒用于体外检测 EDTA 抗凝全血样本中人运动神经元存活基 因 1 （SMN1）和运动神经元存活基因 2（SMN2）第 7 号外显子和第 8 号外显子的拷贝数（0 、1 、2 、3 、≥4）。

SMN1 基因拷贝数用于脊髓性肌萎缩症（spinal  muscular  atrophy， SMA）的辅助诊断，SMN2 基因拷贝数用于 SMA 患者分型的辅助判断， 检测结果供临床参考，临床医生应结合患者临床表现进行综合判断。

脊髓性肌萎缩症（SMA）为一种常染色体隐性遗传疾病，临床特征 为脊髓前角运动神经元退化凋亡导致对称性肌无力和肌萎缩。其病因是 由于位于 5  号染色体上的运动神经元存活基因 1（Survival  of  Motor Neuron 1, SMN1）突变所致。正常人至少有 2 拷贝正常的 SMN1 基因， 携带者仅 1 条 5 号染色体上有正常 SMN1 基因，而 SMA 患者没有正常 SMN1 基因，即 0 拷贝正常 SMN1 基因。

SMN1 突变包括第 7 号和/或第 8 号外显子缺失以及点突变等类型， 其中 95%以上为缺失所致。该病发病率约为 1/10,000~1/6,000，人群携带 率为 1/50-1/40。与 SMN1 高度同源的运动神经元存活基因 2（Survival of Motor Neuron 2, SMN2），两基因序列上仅有 5 个碱基的差异，其中 2 个 碱基位于第 7、8 号外显子上，另 3 个碱基则位于内含子 6、7 中，因 SMN2 第 7 号外显子（c.840T）破坏了一个外显子剪接增强子（exonic splicing enhancer ），导致只有少量的全长 SMN mRNA 生成，使得功能性 SMN 蛋白的表现量减少。SMN2 为临床表型的调节基因，影响病情的严重程 度，其拷贝数增加可减轻 SMA  患者表型症状。因此， 检测 SMN2 基因 的拷贝数有助于为疾病分型提供参考依据。

本试剂盒仅能检测 SMN1 和 SMN2 基因在第 7 号外显子和第 8 号外 显子拷贝数（0 、1 、2 、3 、≥4），不能用于检测点突变引起的 SMN1 和 SMN2 基因异常。

【检验原理】

本试剂盒采用荧光 PCR-毛细管电泳法，针对人类 SMN1、SMN2 基因第 7 号外显子和第 8 号外显子设计特异性的引物，区分 SMN1 和 SMN2。以 HBB 与 ACTB 基因为内标基因，监控 PCR 反应效率，通过 SMN1 与 SMN2 皆为 2 拷贝数的对照品，对 SMN1 、SMN2 基因拷贝数 进行相对定量的检测，区分 0 、1 、2 、3 、≥4 拷贝的 SMN1 与 SMN2 基 因。下表为本试剂盒 6 个检测位点的位置、理论片段长度与荧光修饰。

【主要组成成分】

注：不同批号试剂盒各组分不可以混用，需自备 GeneScan 500 LIZ Size Standard  （Applied  Biosystems，货号 4322682）、Hi-Di  Formamide （Applied  Biosystems，货号 4311320 、4440753）、厦门百欧迅生物 科技有限公司生产的核酸提取试剂（离心柱法，货号 04020001，备 案号：闽厦械备 20200355 号）。

【储存条件及有效期】

本试剂盒于-20±5℃下避光保存，有效期为 18 个月 。

开瓶后未使用完的组分于-20±5℃保存不影响产品有效期。应 尽量避免反复冻融，冻融次数不可超过 6 次。

【适用仪器】

本试剂盒采用普通 PCR  仪扩增后再经毛细管电泳仪进行 PCR  产物分析，经验证可用的 PCR  扩增仪机型为：Life Veriti PCR  扩 增仪与 BIO-RAD T100 PCR  仪；经验证可用的毛细管电泳仪机型为：

Applied Biosystems® 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers。

【样本要求】

1.  样本采集 ：样本类型为 EDTA 抗凝全血，体积应不低于 200μL。

2.  样本保存和运送 ：样本采集后应及时检测，全血可于 2~8℃保存， 并于 2 周内完成检测。于-20±5℃保存不超过 2 年，于-70℃以下保 存不超过 3 年。样本避免反复冻融，冻融次数不超过 4 次。

【检验方法】

1.    样本处理 (  在样本处理区进行)

1.1  取 200μL 全血样本，可使用厦门百欧迅生物科技有限公司生产的核 酸提取试剂（离心柱法，货号 04020001，备案号：闽厦械备 20200355 号），进行人类基因组 DNA 提取。

注：建议当次检测样本与对照的样本处理方式、DNA  提取方法尽 可能相同。

1.2  提取完的 DNA 样本建议立即进行检测，否则应保存于-20±5℃不超 过 2 年，避免反复冻融。

1.3  进行 PCR 扩增的 DNA 模板要求：OD260nm/OD280nm 的比值应在 1.6-2.0 之间，建议 DNA 浓度为 15-60ng/µL，若提取浓度过高可用

SMA 空白对照或者核酸提取试剂的洗脱液进行稀释。

1.4  若提取完的 DNA 浓度未达要求，增加全血样本量提取。

2.    扩增试剂配制 (在试剂配制区进行 )

2.1  取出 SMA 反应液与 SMA  引物混合液，于室温解冻，用震荡器震

荡均匀，以微量离心机短暂离心，使所有液体沉降于管底。 2.2  按下表配制扩增试剂：

*  为了减少分液误差，建议在配制扩增试剂时根据样本数量（n）分别取（n+1） 人份的反应液和混合酶。n=待测样本数 +  SMA 空白对照 1 份 +  SMA 正常对  照 1 份+ SMA 质控品 1 + SMA 质控品 2。

2.3  将配制好的试剂用震荡器震荡均匀，用微量离心机短暂离心，使液 体沉降于管底。

2.4  在 PCR 反应管中分别加入 18μL 配制好的扩增试剂，转移到样本处 理区加样。

3.    加样 (  在样本处理区进行)

3.1  在对应的 PCR 反应管中分别加入 2μL 待测样本、SMA 空白对照、

SMA 正常对照，盖上 PCR 反应管盖后，短暂离心。 3.2    转移至核酸扩增区。

4.    PCR 扩增 (  在核酸扩增区进行)

将PCR 反应管放入PCR 扩增仪，按如下方法设定反应程序进行PCR 扩增。反应体积设定：20  μL，建议立即进行毛细管电泳分析，否 则应将 PCR 扩增产物保存于-20±5℃,不超过 1 周。

5. PCR 产物分析 （在产物分析区进行）

5.1    毛细管电泳仪分析

取 1.5μL PCR 扩增产物、10μL 1% GeneScan 500 LIZ Size Standard （以 10μL  GeneScan   500  LIZ  Size  Standard  加 990μL    Hi-Di Formamide 配制，即为 1% GeneScan 500 LIZ Size Standard），95℃ 变性 3 分钟，立即放冰上 2 分钟，上机检测，按如下方法设定反应 程序。

5.2    软件分析：反应程序结束后，以 GeneMapper 软件对 PCR 扩增产物 进行片段大小分析，分析参数设置和结果分析具体信息请参考制造 商提供的软件操作说明。

5.3    在理论扩增片段长度±3bp 范围内，根据下表进行检测峰挑选。

5.4    检测峰比值（R）计算：SMA 基因各位点按以下公式计算检测峰比 值，其中 Test 代表待测样本，RS 代表 SMA 正常对照，IC 代表 HBB 与 ACTB。

5.4.1 HBB 检测峰比值（R HBB）

HBB 检测峰面积 Test/ IC 检测峰面积之和 Test

R HBB=                                                                                              ×2

HBB 检测峰面积 RS/ IC 检测峰面积之和 RS 5.4.2 SMN1 第 7 号外显子检测峰比值（R SMN1-EX7）

SMN1-EX7 检测峰面积 Test/ IC 检测峰面积之和 Test

R SMN1-EX7=                                                                                        ×2

SMN1-EX7 检测峰面积 RS/ IC 检测峰面积之和 RS 5.4.3SMN2 第 7 号外显子检测峰比值（R SMN2-EX7）

SMN2-EX7 检测峰面积 Test/ IC 检测峰面积之和 Test

R SMN2-EX7=                                                                                       ×2

SMN2-EX7 检测峰面积 RS/ IC 检测峰面积之和 RS 5.4.4 SMN1 第 8 号外显子检测峰比值（R SMN1-EX8）

SMN1-EX8 检测峰面积 Test/ IC 检测峰面积之和 Test

R SMN1-EX8=                                                                                         ×2

SMN1-EX8 检测峰面积 RS/ IC 检测峰面积之和 RS 5.4.5 SMN2 第 8 号外显子检测峰比值（R SMN2-EX8）

SMN2-EX8 检测峰面积 Test/ IC 检测峰面积之和 Test

R SMN2-EX8=                                                                                       ×2

SMN2-EX8 检测峰面积 RS/ IC 检测峰面积之和 RS 5.4.6 ACTB 检测峰比值（R ACTB）

ACTB 检测峰面积 Test/ IC 检测峰面积之和 Test

RACTB =                                                                                       ×2

ACTB 检测峰面积 RS/ IC 检测峰面积之和 RS

【阳性判断值】

样本各位点按 5.4  的公式计算出检测峰比值，若 R  HBB  或 R  ACTB  落于 1.80-2.38 间，SMN 基因的拷贝数按下表结果进行判读。

【检验结果的解释】

1.  质量控制

1.1  SMA 空白对照：无扩增产物峰。

1.2  SMA 正常对照：具有 HBB 、SMN1-EX7、SMN2-EX7 、 SMN1-EX8、 SMN2-EX8 、ACTB，共 6 个检测峰，如下图。

1.3  SMA 质控品 1 ：经 SMA 正常对照计算检测峰比值后，进行 SMN 基因拷贝数判读，SMN1-EX7 与 SMN1-EX8 为 0 拷贝，SMN2-EX7 与 SMN2-EX8 为 2 拷贝 。

1.4  SMA 质控品 2 ：经 SMA 正常对照计算检测峰比值后，进行 SMN 基因拷贝数判读，SMN1-EX7 与 SMN1-EX8 为 1 拷贝，SMN2-EX7 与 SMN2-EX8 为 1 拷贝。

1.5  SMA 正常对照、SMA 质控品 1（其中 SMN1-EX7 与 SMN1-EX8 为 0 拷贝，无检测峰）与 SMN2 质控品 2 的各位点片段大小应符合 下表。

1.6  应同时满足以上要求，此次实验视为有效。

2.  结果判读

2.1  检测峰比值（R）落于正常区间，根据 R  值判读相应拷贝数。样本 的基因型根据判断的拷贝数表示为 SMN1:SMN2，如 0:3 表示 SMN1 基因第 7 号外显子和第 8 号外显子拷贝数均为 0 ，SMN2 基因第 7 号外显子和第 8 号外显子拷贝数均为 3，第 7 号外显子和第 8 号外 显子拷贝数一致 ； 当发生基因转换时 ， 基因型表示为 SMN1-EX7:SMN2-EX7/ SMN1-EX8:SMN2 -EX8，如 0:3/1:2 表示该 样本发生基因转换，SMN1 基因第 7 号外显子拷贝数为 0，SMN2 基 因第 7 号外显子拷贝数为 3 ；SMN1 基因第 8 号外显子拷贝数为 1， SMN2 基因第 8 号外显子拷贝数为 2。

2.2  若检测峰比值 R HBB、R ACTB  同时落于 1.80-2.38 外，需重新进行 PCR 检测，检测结果按上表进行判读。

2.3  若检测峰比值（R SMN1-EX7    、R SMN2-EX7 、 R SMN1-EX8    、R SMN2-EX8 ）落 于检测灰区，需重新进行 PCR，检测结果按【阳性判断值】进行判 读，若检测峰比值（R）还是落于检测灰区，按相应拷贝数判读。

2.4  若 SMN1  与 SMN2 第 7 号外显子的拷贝数之和与第 8 号外显子的拷 贝数之和不一致 ，如 当检测结果为 2:2/2:3  时， 第 7   外显子 SMN1+SMN2 总拷贝数为 2+2=4，第 8 号外显子总拷贝数为 2+3=5， 这种即为总拷贝数不一致，应该重新进行检测。重测后以总拷贝数 一致的结果进行判读，若重测后拷贝数之和仍不一致，建议结合其 他临床指标评估是否以其他检测方法确认。

2.5  若引物扩增区域内出现缺失或插入的罕见基因突变或基因多型性

（polymorphism），出现不符合相应片段长度的检测峰，或者超过 6 个检测峰，可并入检测峰比值计算，确认 SMN1  与 SMN2 第 7 号外 显子的拷贝数之和与 SMN1  与 SMN2 第 8 号外显子的拷贝数之和的 一致性，进行拷贝数判读，进一步的突变或基因多态性信息应结合 临床症状采用测序或者其他检测方法确认。

2.6  若任一检测峰强度超过毛细管电泳仪的荧光饱和强度，需将 PCR 产 物稀释后再进行毛细管电泳仪分析。

2.7    GeneScan 500 LIZ Size Standard 使用浓度或者毛细管电泳仪的上机 条件可依毛细管电泳仪性能与环境条件进行调整。

【检验方法的局限性】

1.    本试剂盒检测结果仅用于疾病的辅助诊断用途，不作为疾病诊断的 唯一依据。对于本试剂盒检测结果，应综合患者临床诊疗及其它实 验室检查手段综合判断。

2.    本试剂盒以染色体上特定的 DNA 序列为检测目标，若引物黏合区 出现罕见的基因突变，使得 SMN1  与 SMN2 第 7 号外显子的拷贝 数之和与 SMN1  与 SMN2 第 8 号外显子的拷贝数之和不一致，而 影响检测结果判读的正确性。

3.    本试剂盒针对 SMN1 与 SMN2 基因的第 7 号外显子和第 8 号外显子 进行检测，区分拷贝数（0 、1 、2 、3 、≥4），当拷贝数≥4  时，以 4 进行计算 SMN1  与 SMN2 第 7 号外显子的拷贝数之和与 SMN1  与 SMN2 第 8 号外显子的拷贝数之和的一致性，若同时存在基因转换

（gene-conversion），可能使两者拷贝数之和不一致，此时需重新检 测，若重测结果与第一次检测结果一致，方可进行结果判读，建议 结合其他临床指标评估是否以其他检测方法确认。

4.    本试剂盒用于检测 SMN1 与 SMN2 基因的第 7 号外显子和第 8 号外 显子拷贝数变异，无法检测罕见突变造成的基因缺陷或 SMN1 基因

型为[2+0]的携带者。

5.    不合理的样本采集、转运及处理、以及不当的试验操作和实验环境 均有可能导致假阴性或假阳性结果。

【产品性能指标】

1.  阳性参考品符合率：检测 11 份企业阳性参考品，结果均符合相对应 的拷贝数要求。

2.  阴性参考品符合率：检测 7 份企业阴性参考品，结果均符合相对应 的拷贝数要求。

3.  最低检测限：不高于 15ng/µL。

4.  精密度：分别对 5 份企业精密度参考品各重复检测 10 次，结果均符 合相对应的拷贝数要求。

5.  交叉反应：

1） 全血样本中常见的病原体，包括乙肝病毒、 丙肝病毒、巨细胞 病毒、肠道病毒 71  型，对本试剂盒检测结果不造成影响；

2） 高拷贝的 SMN2 对 SMN1 不同拷贝数样本（SMN1:SMN2 拷贝 数为 0:2 、0:3 、0:4 、1:1、、1:2 、1:3 、1:4 、2:3 、2:4）的交叉反 应；高拷贝的 SMN1 对不同拷贝数 SMN2（SMN1:SMN2 拷贝数 为 2:0 、2:1 、2:2 、3:0 、3:1 、3:2 、3:3 、4:0 、4:1 、4:2）的交叉 反应结果显示，本试剂盒两个高度同源基因不会对于彼此拷贝数 检测造成影响；

3） 与 SMA 症状类似的 Duchenne  型肌营养不良（DMD）、Becker  型 肌营养不良（BMD）的样本，对本试剂盒检测结果均不造成影 响；

4） SMN 基因微小突变或者基因多型性位点，包括 SMN1 基因的微 小突变为 c.22dupA、c.81+2_3delTG、c.683T>A，SMN1 基因第

7  号外显子常见的基因多型性为 rs555928635 ，SMN2 基因第 8 号外显子常见的基因多型性 rs576032516，对本试剂盒检测结果 均不造成影响。

6.  干扰物质：三酸甘油酯（500mg/dL）、胆红素（15mg/dL）、血红蛋 白（20g/dL）、白蛋白（60g/L）、EDTA 抗凝剂（6μmole/L），与常 见药物如，诺西那生（5mg/mL）、利司扑兰（400ng/mL）、沙丁胺醇 （3μmole/L）、阿莫西林（400μmole/L）、头孢氨苄（600μmole/L）、 乙酰胺基酚（3000μmole/L）、甲氧氯普胺（3μmole/L）与奥美拉唑 （40μmole/L），对本试剂盒检测结果均不造成影响。

7.  临床试验总结：本产品的临床试验在五家临床试验单位共检测符合 预期用途适用人群样本 975 例，SMN1 拷贝数 0 、1 为阳性样本，2  及以上拷贝为阴性样本，本试验在 SMN1 基因外显子 7 检出阳性样 本 471 例，阴性样本 504 例，在外显子 8 检出阳性样本 452 例，阴  性样本 523 例；结果表明，本产品检测样本 SMN1 与 SMN2 基因拷 贝数与金标准 MLPA 方法完全一致，各基因的不同拷贝数、SMN1  基因阳性和阴性样本的检测灵敏度、特异性、总符合率均为 100%， Kappa 值均为 1；与临床诊断相比，考核试剂在其检测范围内检测结 果与临床诊断结果一致；本试验具有表型分型信息的患者共 249 例，

2 拷贝 SMN2 患者多为 1 型，3 拷贝多为 2 型，4 拷贝则多表现为 3 型，SMN2  基因拷贝数与患者分型分布趋势均与文献一致；本试验 入组的不同分型的患者数量分布符合文献发生概率与临床诊疗实际 情况。

【注意事项】

1.    严格遵守本说明书操作要求所得结果才能被认为是有效测试。

2.    建议本试剂盒所有使用的仪器设备包括 PCR  扩增仪、毛细管电泳 及微量移液器等均在使用前完成校正。

3.    实验室应严格按 PCR  基因扩增实验室管理规范进行管理，实验人 员必须经过专业培训，实验过程严格分区进行，各区实验用品不得 交叉使用。

4.    对所有的检测样本视为潜在的传染源，样本操作及废弃物处理均须 符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用 准则》和《医疗废物管理条例》。

【参考文献】

[1]    Nurputra DK, Lai PS, Harahap NI, Morikawa S, Yamamoto T,

Nishimura N, KuboY, Takeuchi A, Saito T, TakeshimaY, Tohyama Y,

Tay SK, Low PS, Saito K, Nishio H. Spinal muscular atrophy: from gene discovery to clinical trials. Ann Hum Genet. 2013

Sep;77(5):435-63.

[2]  Prior TW, Nagan N, Sugarman EA, Batish SD, Braastad C. Technical        standards and guidelines for spinal muscular atrophy testing.Genet Med.

2011 Jul;13(7):686-94.

[3]  Butchbach ME. Copy Number Variations in the Survival Motor Neuron Genes: Implications for Spinal Muscular Atrophy and Other                   Neurodegenerative Diseases. Front Mol Biosci 2016; 3:7.

【基本信息】

注册人/生产企业名称：厦门百欧迅生物科技有限公司

住所：厦门市海沧区翁角西路 2032 号厦门生物医药产业园 A17  号楼 4

层之二

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生产地址：厦门市海沧区翁角西路 2032 号厦门生物医药产业园 A17 号 楼

生产许可证编号：

【医疗器械注册证编号/产品技术要求编号】 【说明书批准/生效日期及修改日期】